姜淼，馬志斌，李小雪，牛思佳

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，哈爾濱150001

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率較高，且全世界結(jié)直腸癌的發(fā)病率以每年2%的速度上升[1]。近年來，迅速發(fā)展的診療技術(shù)，極大地改善了結(jié)直腸癌患者的預(yù)后，但是其病死率仍然居高不下。部分結(jié)直腸癌患者被確診時(shí)，已達(dá)疾病晚期，嚴(yán)重影響患者的治療，而新的腫瘤標(biāo)志物將有助于結(jié)直腸癌患者的早期診斷和治療。作為轉(zhuǎn)錄延伸因子A樣蛋白家族成員，轉(zhuǎn)錄延伸因子類（transcriptional elongation factor like 7，TCEAL7）全長(zhǎng)2138 bp，編碼100個(gè)氨基酸，依賴啟動(dòng)子調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄[2-3]。研究顯示，TCEAL7在胃癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤組織中低表達(dá)[4-6]。以上研究提示，TCEAL7具有成為腫瘤標(biāo)志物的價(jià)值，但其在結(jié)直腸癌中的研究報(bào)道較少。研究顯示，TCEAL7在結(jié)直腸癌細(xì)胞中低表達(dá)，如過表達(dá)TCEAL7，可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。但此項(xiàng)研究?jī)H關(guān)注腫瘤細(xì)胞的TCEAL7表達(dá)變化，并未在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)變化。Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)亡有關(guān)。研究顯示，該Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以在多種腫瘤的發(fā)生中被激活并發(fā)揮關(guān)鍵的作用，如結(jié)直腸癌[7-8]，同時(shí)在結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[9-10]。Wnt和β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要元件，通過對(duì)其檢測(cè)可以反映Wnt/β-catenin信號(hào)通路的變化。因此，本研究重點(diǎn)檢測(cè)結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織中TCEAL7、Wnt、β-catenin 的表達(dá)情況 ，分析TCEAL7、Wnt、β-catenin的表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系，分析TCEAL7表達(dá)與Wnt、βcatenin表達(dá)的相關(guān)性，分析TCEAL7表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2005年1月至2010年12月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院接受手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①出現(xiàn)結(jié)直腸癌的臨床癥狀，并符合結(jié)直腸癌診斷，術(shù)后病理證實(shí)為結(jié)直腸癌；②術(shù)前無輔助放化療；③行一期手術(shù)切除；④病理組織均殘留少部分正常組織（距腫瘤組織約2.0 cm），標(biāo)本保存完好；⑤臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：治療中斷的患者。根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入50例結(jié)直腸癌患者，其中男性35例，女性15例；年齡為26～75歲，平均年齡為（56.2±8.6）歲。

1.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)

檢測(cè)TCEAL7基因及Wnt、β-catenin蛋白的表達(dá)情況，分析三者的表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系，分析三者表達(dá)情況的相關(guān)性，分析TCEAL7基因的表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系。隨訪方式為電話隨訪和門診復(fù)查的方式相結(jié)合，隨訪時(shí)間為63個(gè)月。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1TCEAL 7基因的檢測(cè) 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)TCEAL7基因的相對(duì)表達(dá)量。采用TRIzol試劑盒（購(gòu)于Promega公司）提取結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的mRNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)于Promega公司）將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，TCEAL7基因長(zhǎng)度為234 bp；以β-actin為內(nèi)參，長(zhǎng)度為315 bp（表1），經(jīng)上海生工公司合成。采用熒光定量PCR試劑盒（購(gòu)于全式金公司）進(jìn)行檢測(cè)[11]。TCEAL7＞0.32為高表達(dá)。

表1 TCEAL 7和 β-actin的引物序列

1.3.2 Wnt和 β-catenin蛋白的檢測(cè) 取每例結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織的石蠟組織切片，采用鼠抗人Wnt、β-catenin單抗及免疫組化試劑盒（購(gòu)于武漢博士德生物公司），參考Soini[12]改良法的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。根據(jù)BX53顯微鏡（購(gòu)于奧林巴斯）400倍視野下染色細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度分析蛋白表達(dá)水平。參照王愛民等[13]的染色細(xì)胞所占比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＜10%；1分，10%≤陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＜40%；2分，40%≤陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＜70%；3分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例≥70%。細(xì)胞染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[13]：0分，不著色；1分，染色呈黃色；2分，染色呈棕黃色；3分，染色呈黃褐色。蛋白水平的評(píng)分=陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分+細(xì)胞染色評(píng)分，0～3分為低表達(dá)，4～6分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法繪制TCEAL7高、低表達(dá)患者的生存曲線，采用Log-rank法比較TCEAL7高、低表達(dá)患者的生存情況。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCEAL 7基因的相對(duì)表達(dá)量

TCEAL7基因在50例結(jié)直腸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為（0.36±0.02），明顯低于50例癌旁正常組織的（1.20±0.13），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.659，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征的結(jié)直腸癌患者TCEAL 7、Wnt、β-catenin的表達(dá)情況

不同臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況的結(jié)直腸癌患者的TCEAL7的表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.433、6.566、3.979，P=0.020、0.010、0.046），但不同性別、年齡結(jié)直腸癌患者的TCEAL7的表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況的結(jié)直腸癌患者的Wnt的表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.160、7.219、6.349，P=0.041、0.007、0.012），但不同性別、年齡結(jié)直腸癌患者的Wnt的表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況的結(jié)直腸癌患者的β-catenin的表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.631、10.141、7.028，P=0.003、0.001、0.008），但不同性別、年齡結(jié)直腸癌患者的β-catenin的表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征的結(jié)直腸癌患者TCEAL 7、Wnt、β-catenin的表達(dá)情況

2.3 TCEAL 7表達(dá)情況與Wnt、β-catenin表達(dá)情況的相關(guān)性

結(jié)直腸癌組織中TCEAL7的表達(dá)情況與Wnt、βcatenin的表達(dá)情況均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.583、-0.392，P＜0.01）。（表3）

表3 結(jié)直腸癌組織中TCEAL 7表達(dá)情況與Wnt、β-catenin表達(dá)情況的對(duì)照

2.4 TCEAL 7表達(dá)情況與預(yù)后的關(guān)系

TCEAL7高表達(dá)患者的生存情況優(yōu)于TCEAL7低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.559，P=0.032）。（圖1）

3 討論

圖1 TCEAL 7低表達(dá)（ n=32）與高表達(dá)（ n=18）結(jié)直腸癌患者的生存曲線

本研究顯示，結(jié)直腸癌組織中TCEAL7的相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織（P＜0.01），同時(shí)不同臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況的結(jié)直腸癌患者的TCEAL7、Wnt、β-catenin的表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但不同性別、年齡結(jié)直腸癌患者的TCEAL7、Wnt、β-catenin的表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；結(jié)直腸癌組織中TCEAL7的表達(dá)情況與Wnt、βcatenin的表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。進(jìn)一步分析TCEAL7表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TCEAL7高表達(dá)患者的生存情況優(yōu)于TCEAL7低表達(dá)患者（P＜0.05），說明TCEAL7具備作為結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)志物的潛在價(jià)值。TCEAL7位于22.1-22.2區(qū)域的X染色體長(zhǎng)臂，含有轉(zhuǎn)錄因子A（transcription factor A，TFA）結(jié)構(gòu)域，可以通過依賴啟動(dòng)子調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。Chien等[4]發(fā)現(xiàn)，TCEAL7在卵巢癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)甚至無表達(dá)；過表達(dá)TCEAL7，可以抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并可以在轉(zhuǎn)錄水平抑制NF-κB，c-myc和cyclin D1的表達(dá)。Huang等[6]報(bào)道，在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中TCEAL7低表達(dá)，且TCEAL7的表達(dá)量與病灶的大小、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示TCEAL7可能有評(píng)估胃癌患者預(yù)后的價(jià)值。

TCEAL7通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮其對(duì)腫瘤細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。TCEAL7在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用。Wnt和β-catenin是Wnt/βcatenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，在Wnt作用下βcatenin的磷酸化受到抑制，細(xì)胞質(zhì)中β-catenin水平高，β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)；當(dāng)Wnt信號(hào)被異常激活時(shí)，引起細(xì)胞增殖、分化的異常[7,9,14-15]。結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞核β-catenin的表達(dá)情況與肝轉(zhuǎn)移有關(guān)[8,16]。結(jié)直腸癌浸潤(rùn)前沿細(xì)胞βcatenin表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中β-catenin的表達(dá)水平亦隨之升高[17]。這與本研究結(jié)果一致。本研究同時(shí)顯示，結(jié)直腸癌組織中TCEAL7的表達(dá)情況與Wnt、β-catenin的表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。綜上所述，TCEAL7、Wnt、β-catenin 表達(dá)可能與結(jié)直腸癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，TCEAL7與Wnt、β-catenin呈負(fù)相關(guān)。TCEAL7表達(dá)的高低可以提示結(jié)直腸癌患者的預(yù)后，具有作為腫瘤標(biāo)志物的價(jià)值。