施柳輝，施飛，戴軍，何竑超#，何威，徐丹楓

1民航上海醫(yī)院泌尿外科，上海200336

2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院泌尿外科，上海200025

腎癌骨轉(zhuǎn)移是影響腎癌患者臨床預(yù)后的重要因素。流行病學(xué)調(diào)查顯示，近年來(lái)腎癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率呈持續(xù)性上升的趨勢(shì)[1]。臨床上發(fā)生腎癌骨轉(zhuǎn)移能夠?qū)е禄颊卟∷缆噬仙?年生存率顯著下降，致殘風(fēng)險(xiǎn)升高[2]。腫瘤相關(guān)因子的改變能夠影響腫瘤細(xì)胞對(duì)骨質(zhì)細(xì)胞的黏附能力，增加發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。促分裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）能夠改變腫瘤細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮或淋巴結(jié)的黏附能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[3-4]。近年來(lái)已有研究證實(shí)，MEK和ERK蛋白在卵巢癌、甲狀腺癌、肝癌、腎癌等惡性腫瘤的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，MEK和ERK蛋白的高表達(dá)是導(dǎo)致患者臨床分期晚、腫瘤細(xì)胞分化程度下降、術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)升高的重要因素[5-6]，但目前尚缺乏MEK和ERK蛋白表達(dá)與腎癌骨轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究。本研究回顧性分析80例原發(fā)性腎癌患者的臨床資料，探討MEK和ERK蛋白表達(dá)與腎癌骨轉(zhuǎn)移的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2015年1月至2017年6月于民航上海醫(yī)院治療的原發(fā)性腎癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理組織學(xué)確診為原發(fā)性腎癌；②術(shù)前未行靶向治療、放療、化療或免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床或病理資料不完整者。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入80例原發(fā)性腎癌患者。80例患者中，男46例，女34例；年齡38～67歲，中位年齡51歲；病理類型：透明細(xì)胞癌64例，乳頭狀細(xì)胞癌9例，嫌色細(xì)胞癌7例；有骨轉(zhuǎn)移12例，無(wú)骨轉(zhuǎn)移68例。收集患者的腎癌原發(fā)灶組織、癌旁組織（距腫瘤邊緣＞5 cm）、骨轉(zhuǎn)移灶組織標(biāo)本。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫避光放置10 min，加入10 mmol/L pH 6.0的枸櫞酸鈉緩沖液2 ml進(jìn)行抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗5 min，滴加正常山羊或兔血清封閉處理，37℃，15 min。用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加一抗，37℃，2 h；滴加生物素化二抗，37℃，40 min；PBS沖洗5 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，加拿大樹膠（或中性樹膠）封片。

1.3 結(jié)果判斷

MEK和ERK蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。采用雙評(píng)分半定量法進(jìn)行評(píng)分[6]，依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞比例＜5%為1分，5%～50%為2分，≥51%為3分；依據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：未著色為1分，淡黃色為2分，黃色為3分，棕黃色為4分。最終得分為陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度評(píng)分之積，≤4分為陰性表達(dá)，＞4分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中MEK和ERK蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較

有骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶和無(wú)骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；有骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶和無(wú)骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。骨轉(zhuǎn)移灶中MEK和ERK蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均高于無(wú)骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶和有骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表 1）

表1 不同腎組織中MEK和ERK蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況的比較[ n（%）]

2.2 不同病理類型腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較

透明細(xì)胞癌、乳頭狀細(xì)胞癌和嫌色細(xì)胞癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同病理類型腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況[ n（%）]

2.3 MEK和ERK蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

骨轉(zhuǎn)移灶中MEK和ERK蛋白表達(dá)無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），無(wú)骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.707，P＜0.05），有骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白表達(dá)也呈正相關(guān)（rs=0.897，P＜0.05）。（表3～表5）

表3 骨轉(zhuǎn)移灶中MEK和ERK蛋白表達(dá)的相關(guān)性

表4 無(wú)骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白表達(dá)的相關(guān)性

表5 有骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

腎癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制較為復(fù)雜，但一般認(rèn)為與自身遺傳易感性、骨質(zhì)局部解剖結(jié)構(gòu)或者分子生物學(xué)改變等有關(guān)。特別是在病程較長(zhǎng)、臨床分期較晚的腎癌患者中，骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯升高[7]?，F(xiàn)階段臨床上主要通過(guò)影像學(xué)檢查評(píng)估骨轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，但單純磁共振檢查或者X線檢查評(píng)估骨轉(zhuǎn)移的價(jià)值較為局限。ERK蛋白相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)在評(píng)估惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)中具有重要的指導(dǎo)價(jià)值，具有檢查方便、費(fèi)用較低等優(yōu)勢(shì)。通過(guò)對(duì)腎癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機(jī)制的研究，能夠?yàn)榕R床上腎癌骨轉(zhuǎn)移的免疫靶向治療提供新的參考靶點(diǎn)。

MEK和ERK蛋白是重要的腫瘤相關(guān)蛋白，其上游啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的增加能夠提高ERK蛋白的翻譯活性，使腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征明顯改變[8]。ERK蛋白上調(diào)能夠通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)能力而增加腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)?；A(chǔ)方面的研究表明，ERK蛋白翻譯增加是導(dǎo)致骨干骺端骨質(zhì)細(xì)胞密度改變、局部干骺端新生血管通透性改變、血流緩慢的重要因素，而相關(guān)病理過(guò)程的發(fā)生均可以增加腎癌細(xì)胞發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[5]。另外，MEK/ERK信號(hào)通路的激活能夠誘導(dǎo)趨化因子的富集，特別是CXCL4、CXCL3等的上調(diào)能夠誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞黏附分子表達(dá)水平的變化，增加腫瘤細(xì)胞黏附骨質(zhì)細(xì)胞、骨小梁的可能[9-10]。有研究認(rèn)為，MEK和ERK蛋白高表達(dá)是促進(jìn)腎癌患者臨床分期進(jìn)展的重要因素[10]，但關(guān)于腎癌原發(fā)病灶及骨轉(zhuǎn)移病灶中MEK和ERK蛋白的分析研究不足。

本研究結(jié)果顯示，有骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶和無(wú)骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示MEK和ERK蛋白均可能參與了腎癌的發(fā)生過(guò)程，考慮可能的原因如下[11-12]：①M(fèi)EK蛋白高表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞DNA的擴(kuò)增，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞突破基底膜的風(fēng)險(xiǎn)增加；②ERK蛋白高表達(dá)能夠?qū)е履I癌上皮細(xì)胞的異型性改變，增加腫瘤細(xì)胞的核分裂象。本研究結(jié)果表明，在不同病理類型的腎癌組織中，MEK和ERK蛋白的表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示MEK和ERK蛋白表達(dá)的差異并不會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的病理類型，這可能是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的病理類型主要與腫瘤細(xì)胞分化過(guò)程中誘導(dǎo)分子的調(diào)控作用有關(guān)。秦彩朋等[13]研究表明，腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白的表達(dá)水平均低于骨轉(zhuǎn)移灶（P＜0.05）。本研究結(jié)果表明，骨轉(zhuǎn)移灶中MEK和ERK蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均高于無(wú)骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶和有骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶（P＜0.05），提示MEK和ERK蛋白的表達(dá)水平與骨轉(zhuǎn)移過(guò)程有關(guān)。MEK和ERK蛋白對(duì)于骨轉(zhuǎn)移發(fā)生的影響，主要由于二者可以增加骨小梁局部血管內(nèi)皮的通透性，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞突破血管內(nèi)皮，使其黏附骨小梁的可能性增大，同時(shí)ERK蛋白還可誘導(dǎo)骨源性趨化因子的生成，啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞的特異性黏附過(guò)程[14]。本研究的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在無(wú)骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶和有骨轉(zhuǎn)移的腎癌原發(fā)灶中MEK和ERK蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)（P＜0.05），提示在腎癌發(fā)病的早期，MEK和ERK蛋白發(fā)揮了重要的協(xié)同刺激作用；而在骨轉(zhuǎn)移灶中，MEK和ERK蛋白表達(dá)無(wú)相關(guān)性。

綜上所述，腎癌骨轉(zhuǎn)移灶中MEK和ERK蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均高于原發(fā)灶，MEK和ERK蛋白可能參與了腎癌骨轉(zhuǎn)移過(guò)程，值得進(jìn)一步研究。