王 靜，劉 芳，楊曉瓊

(重慶市紅十字會醫(yī)院/江北區(qū)人民醫(yī)院檢驗科 400020)

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其中85%左右為非小細胞肺癌，其病死率在腫瘤中位居首位；盡管手術及放化療對治療肺癌有很大幫助，但由于大多數肺癌患者初次發(fā)現(xiàn)時已屬中晚期，發(fā)生了遠處轉移。而遠處轉移最常見的是骨轉移，特別是溶骨性轉移，因此導致患者錯過了最佳治療時機，故其五年生存率仍然很低[1-3]。此外，近年來由于靶向藥物帶來耐藥問題也逐漸增多，因此，尋找新的分子標志物對肺癌的診斷和治療有著至關重要的作用[4]。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)屬于轉化生長因子-β(TGF-β)超家族中的一員，通過調節(jié)細胞的分化、增殖、凋亡等生物學活性參與組織器官的形成和發(fā)展，特別是骨或軟骨形成的關鍵因子[5]。近年來，不少研究報道BMPs對腫瘤生長和轉移的影響尤為重要。已有研究顯示BMPs家族中BMP2、BMP7等在肺癌的生長轉移中也有重要的作用[6-7]，而BMP9作為BMPs中促成骨作用最強、發(fā)現(xiàn)較晚的一員，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等腫瘤中多有報道[8-9]，而對肺癌生長和轉移的影響還未見報道。本課題組前期檢測出BMP9在正常支氣管上皮細胞的中表達高于非小細胞肺癌細胞；肺癌細胞過表達BMP9后，其增殖、遷移、侵襲能力降低，凋亡能力增加；A549細胞與骨髓基質細胞HS-5共培養(yǎng)后，A549細胞的增殖、遷移、侵襲能力增強，而BMP9抑制了這一作用，其機制可能與MAPK/ERK和NF-κB信號通路的激活有關[10-11]。但前期裸鼠皮下成瘤實驗中未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉移到肝臟、肺或骨等其他器官，因此對肺癌骨轉移方面的動物實驗還需進一步的研究。本研究采用裸鼠脛骨外貼骨處注射肺癌細胞構建脛骨轉移模型，探討B(tài)MP9對肺癌骨轉移的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人肺腺癌細胞A549購自美國菌種保藏中心(ATCC)。表達綠色熒光蛋白的空載腺病毒AdGFP和AdBMP9由美國芝加哥大學何通川教授惠贈。采用重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供16只4～6周齡雄性非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)裸鼠構建肺癌裸鼠脛骨轉移模型。

1.2試劑和儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；聚合酶鏈式反應(PCR)引物由上海百力格公司合成；蛋白裂解液購自上海碧云天公司；兔抗BMP9抗體購自美國Abcam公司；鼠抗β-actin抗體、山羊抗鼠(或抗兔)IgG購自北京中杉金橋公司；堿性磷酸酶(AKP)染液購自南京建成科技有限公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng)和病毒感染 A549細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，當細胞密度達90%左右時，用胰酶消化并傳代。病毒感染時，待細胞生長密度達70%，每孔加入6 μL聚凝胺和重組腺病毒；24 h后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況，以感染30%細胞的病毒量為合適的滴度。

1.3.2qRT-PCR檢測細胞中BMP9基因 收集腺病毒感染或未感染的A549細胞，Trizol法提取總RNA，逆轉錄后的cDNA進行PCR擴增，PCR反應體系為10 L，引物序列及產物長度見表1，PCR反應條件：95 ℃，30 s；95 ℃、10s，55 ℃、20 s，72 ℃、20 s，40個循環(huán)；72 ℃，10 min。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測細胞中BMP9蛋白 收集腺病毒感染或未感染的A549細胞，提取總蛋白，與蛋白Buffer混勻后，沸水中煮10 min，至蛋白變性。取50 μg蛋白樣品，4 ℃進行聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳、濕轉、封閉，一抗孵育過夜(抗體稀釋比例：BMP9，1∶500；β-actin，1∶1 000)、洗膜、二抗37 ℃育1 h、洗膜、顯影，用Quantity One軟件對條帶進行分析。

1.3.4構建肺癌裸鼠脛骨轉移模型 收集腺病毒感染或未感染的A549細胞，150 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)中重懸，冰上放置備用。實驗分為4組：PBS對照組，A549組(6×106)，A549/GFP組(6×106)，A549/BMP9組(6×106)。將16只裸鼠隨機分為4組，每組4只。將準備好的細胞懸液注射到裸鼠脛骨外貼骨處。定期觀察裸鼠后肢脛骨腫瘤生長情況，6周后麻醉裸鼠，到重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院放射科對裸鼠脛骨行X線檢查；之后處死裸鼠，取出脛骨組織，用4%多聚甲醛固定24 h后，10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣、包埋。

1.3.5蘇木精-伊紅染色(HE染色) 石蠟組織切成5 μm厚度，烤片過夜，經脫蠟及水化(依次為二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→二甲苯Ⅲ→無水乙醇Ⅰ→無水乙醇Ⅱ→95%乙醇→90%乙醇→80%乙醇→70%乙醇→蒸餾水)，HE染色，鹽酸酒精分化，脫水及透明(依次為70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→95%乙醇→無水乙醇Ⅰ→無水乙醇Ⅱ→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ)，封片，照相。

1.3.6AKP染色 石蠟組織切片、二甲苯脫蠟，水化(依次為95%乙醇→75%乙醇→30%乙醇→蒸餾水)，將玻片放入基質液染缸中，37 ℃孵育15 min，不要水洗，移至顯色液A染色5 min，顯色液B染色30 s，再放入復染劑中染色30 s，水洗30 s，甩干，鏡檢。染色呈現(xiàn)灰黑色顆?；驂K狀則為陽性。

2 結 果

2.1A549細胞中BMP9的基因和蛋白水平表達 分別將AdGFP和AdBMP9感染A549細胞，24 h后感染效率為80%以上。提取各組細胞做BMP9基因和蛋白水平檢測，qRT-PCR及Western blot結果顯示，A549細胞感染AdBMP9后，BMP9的基因和蛋白表達水平較陰性對照組明顯上調(P<0.001)，由此證實BMP9在A549細胞中成功過表達。見圖1、2。

圖1 qRT-PCR檢測細胞中BMP9基因表達情況

圖2 Western blot檢測細胞中BMP9蛋白表達情況

2.2BMP9抑制肺癌細胞A549的脛骨轉移情況 脛骨外貼骨處注射肺癌細胞3周左右，裸鼠脛骨周圍瘤體的大小有明顯差異；6周后麻醉裸鼠行X線成像，PBS對照組骨組織完整，無肌肉腫脹等情況發(fā)生，A549組和A549/GFP組肺癌細胞浸潤到裸鼠骨組織及周圍軟組織，裸鼠后肢明顯增粗，其直徑為陰性對照組的3～4倍，發(fā)生了明顯的腫瘤侵襲和骨質破壞，A549/BMP9組骨及周圍軟組織損壞區(qū)域和損害程度較對照組明顯減少。

2.3BMP9抑制肺癌對脛骨溶骨損害情況 肺癌發(fā)生骨轉移最常見的類型是溶骨性轉移，對骨造成了嚴重的損害。處死已照X線片的裸鼠，取出脛骨組織脫鈣，做HE染色和AKP染色。HE染色顯示，A549組和A549/GFP組脛骨髓腔中有明顯的腫瘤細胞浸潤，周圍骨質已不完整，并且有的裸鼠脛骨骨髓已完全被腫瘤組織占據，而A549/BMP9組中髓腔破壞較輕。AKP是成骨發(fā)生中一個重要的標志，本研究顯示，A549組和A549/GFP組骨質溶解破壞嚴重，髓腔被大量腫瘤細胞浸潤，染色偏紅色，其AKP陽性率為40%，而A549/BMP9組大多為完整骨組織，AKP染色呈灰黑色，陽性率為75%，明顯高于對照組。見圖3。

注：A為PBS對照組；B為A549組；C為A549/GFP組；D為A549/BMP9組

圖3 BMP9抑制了肺癌細胞對脛骨的溶骨損害(HE,×100)

3 討 論

肺癌成為全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，其主要原因是容易發(fā)生轉移，特別是溶骨性轉移，嚴重影響患者的預后，成為治療肺癌最大的阻礙，因此尋找新的分子標志物對于早期診斷和治療肺癌，延緩骨轉移的破壞作用至關重要。

BMPs在胚胎期肺和支氣管的發(fā)育過程中有非常重要的作用[12-13]，目前對BMPs在肺癌中的研究也逐漸增多，不同亞型的BMP在不同類型的肺癌組織中表達和作用不同[14-16]；如BMP2肺癌中過表達，促進肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力；BMP3b在非小細胞肺癌中低表達；BMP4可負向調控肺癌細胞的生長，促進肺腺癌細胞A549的衰老；BMP5的mRNA和蛋白水平在肺腺癌細胞中的表達較肺鱗癌細胞中高；BMP7可促進肺癌細胞的遷移和侵襲，但對其增殖和凋亡并沒有影響[17-19]。由此可見，BMPs在肺癌中的作用尤為重要，值得深入探究。成骨作用強的BMP9在其他腫瘤中有重要的作用，而在肺癌中報道較少。

基于前期實驗檢測出BMP9在體外抑制了肺癌細胞A549增殖、遷移和侵襲能力，其機制可能與MAPK/ERK和NF-κB信號通路的激活有關。本研究采用裸鼠脛骨外貼骨注射肺癌細胞構建脛骨轉移模型，結果顯示，注射A549細胞6周后，PBS對照組、A549/GFP組裸鼠脛骨周圍瘤體明顯大于A549/BMP9組；肺癌細胞浸潤到裸鼠骨組織，發(fā)生了明顯的侵襲和骨質破壞溶解，AKP染色面積和強度減少，而A549/BMP9組骨損壞區(qū)域和溶骨程度明顯減少。此研究進一步證實了BMP9對肺癌細胞增殖、轉移的抑制作用。

綜上所述，BMP9可在體內外抑制非小細胞肺癌的增殖和轉移能力，但其在臨床肺癌患者不同分型的肺癌組織及癌旁組織是否有差異，還需收集大量的臨床標本驗證，為肺癌的臨床診斷和治療提供更多理論基礎。