徐小軍，李 可，張桂蘭

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所 鄭州 450009； 2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所 廣東湛江 524091)

南瓜(CucurbitaL.)屬于葫蘆科一年生草本植物，擁有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量和良好的食療保健作用，在世界范圍內(nèi)廣泛種植。南瓜含有20余種營(yíng)養(yǎng)成分，特別是類胡蘿卜素、多糖、果膠、葫蘆巴堿等，可作為天然保健營(yíng)養(yǎng)成分，已成為近年來研究熱點(diǎn)[1-2]。南瓜中含有豐富的類胡蘿卜素，絕大多數(shù)品種中以β-胡蘿卜素為主[3]。南瓜果肉中的類胡蘿卜素含量(鮮質(zhì)量)高達(dá) 40.5 mg·100 g-1，其中 β-胡蘿卜素含量為24.4 mg·100 g-1[4]。類胡蘿卜素是一種有效的單線態(tài)氧淬滅器，具有解鏈抗氧化作用，保護(hù)細(xì)胞和其他身體成分免受自由基攻擊，提高人體免疫力，降低早衰、癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、白內(nèi)障、老年性黃斑變性和一系列退化性疾病的發(fā)生率。β-胡蘿卜素具有良好的維生素A原的活性，維生素A對(duì)上皮細(xì)胞的正常生長(zhǎng)與分化、維持正常視覺、促進(jìn)骨骼發(fā)育具有重要的生理作用，食用β-胡蘿卜素含量較高的食品不僅可以防止缺乏維生素A引起的各種疾病，還能降低心臟病、癌癥等疾病的發(fā)病率。把優(yōu)質(zhì)南瓜作為質(zhì)優(yōu)、價(jià)廉的胡蘿卜素來源具有重要意義。

目前關(guān)于南瓜果肉類胡蘿卜素含量的研究，主要是關(guān)于不同中國(guó)南瓜(Cucurbita moschata)、印度南瓜(C.maxima)、美洲南瓜(C.pepo)栽培種中類胡蘿卜素含量和種類差異，或是不同品種成熟期類胡蘿卜素含量差異的研究，而關(guān)于不同品種不同發(fā)育時(shí)期類胡蘿卜素積累規(guī)律的研究還未見報(bào)道[3,5-8]，并且關(guān)于南瓜果肉類胡蘿卜素的最佳提取工藝也不盡相同[9-10]。因此，筆者選取了國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上比較暢銷的5個(gè)不同類型的南瓜品種，擬通過單因素和正交試驗(yàn)篩選出南瓜果肉類胡蘿卜素的最佳提取工藝，并通過測(cè)定果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期類胡蘿卜素含量，來推測(cè)不同南瓜品種中類胡蘿卜素的積累與變化規(guī)律，為南瓜類胡蘿卜素提取和品質(zhì)育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為5個(gè)不同的南瓜商品種(A:‘迷你荃鑫’；B:‘綠圓’；C:‘荃鑫6號(hào)’；D:‘黑晶’；E:‘早豐蜜’)，除了‘早豐蜜’屬于中國(guó)南瓜外，其余4個(gè)均為印度南瓜。材料于2016年3月種植于中牟縣設(shè)施大棚內(nèi)，采用吊蔓種植，3蔓整枝，株行距0.6 m×2.0 m，采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4行，每行15株，開花期人工授粉，常規(guī)肥水管理。分別于授粉后 7、14、21、28、35、42、49、56 d 取樣，南瓜果實(shí)去皮、去籽，保留果肉，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，后續(xù)試驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 最佳提取溶劑的篩選 分別以無水乙醇、甲醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、V丙酮∶V石油醚=1∶1、V丙酮∶V石油醚=1∶2、V丙酮∶V石油醚=2∶1(后同)的試劑為提取溶劑，以品種C‘荃鑫6號(hào)’花后56 d的樣品為試驗(yàn)材料，稱取0.5 g樣品，加入5 mL溶劑，避光浸提30 min，12 000 r·min-1離心 10 min，吸取上清液至25 mL容量瓶中，沉淀中再次加5 mL浸提劑，重復(fù)上述操作，直至樣品呈白色。用浸提溶劑定容，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取液在450 nm處的吸光值。

1.2.2 最佳處理方法篩選 分別以超聲波和微波處理為輔助手段提取南瓜果肉中的類胡蘿卜素，以

1.2.1中篩選到的無水乙醇為提取溶劑，試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇處理時(shí)間、料液比、抽提次數(shù)為考察因素，以類胡蘿卜素提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，參照L9(34)正交表(表1)安排試驗(yàn)，篩選南瓜果肉類胡蘿卜素提取的最佳條件。

表1 正交試驗(yàn)的因素與水平

1.2.4 南瓜果肉類胡蘿卜素的提取 用萬能高速粉碎機(jī)加液氮將南瓜果肉粉碎成粉末狀，稱取0.5 g樣品，加入2 mL浸提劑，避光超聲浸提8 min，12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液至25 mL容量瓶中，沉淀中再次加入2 mL浸提劑，重復(fù)上述操作，共抽提4次，直至樣品呈白色。用浸提劑定容，備用。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品450 nm處的吸光值。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用分析天平準(zhǔn)確稱取2 mg的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇溶解，定容至100 mL，制成β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)液。移液槍分別取0.2、0.4、2、4、6、8、10 mL 標(biāo)準(zhǔn)液，用無水乙醇定容至10 mL，于450 nm處測(cè)吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 類胡蘿卜素提取率計(jì)算 類胡蘿卜素提取率計(jì)算公式為:X=[(C×V)/W]×100。式中，X為類胡蘿卜素提取率(mg·100 g-1)；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的類胡蘿卜素質(zhì)量濃度(mg·mL-1)；V為浸提溶液最終定容體積(mL)；W為稱量的南瓜果肉鮮質(zhì)量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和SPSS 22.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖1可知，樣品濃度與吸光值OD450呈高度線性相關(guān)，線性方程為Y=64.253X+0.047 4(R2=0.999 2)。因此，試驗(yàn)中可根據(jù)此線性方程進(jìn)行類胡蘿卜素含量的計(jì)算。

2.2 南瓜果肉類胡蘿卜素最佳提取劑的確定

選取8種已報(bào)道的用于類胡蘿卜素提取最多的溶劑，提取‘荃鑫6號(hào)’南瓜果肉中類胡蘿卜素，然后測(cè)定提取液在450 nm處的吸光值。由圖2可知，這8種提取劑在同一條件下，無水乙醇的提取率顯著高于其他幾種溶劑，石油醚提取率最低，顯著低于其他7種提取溶劑，剩下6種溶劑提取效果無顯著差異。

2.3 南瓜果肉類胡蘿卜素提取最佳處理方法的確定

由于類胡蘿卜素常溫下不穩(wěn)定，因此為防止類胡蘿卜素降解，提取過程應(yīng)盡可能縮短提取時(shí)間。筆者嘗試?yán)贸暡ê臀⒉ㄌ幚韥磔o助類胡蘿卜素的提取。參考2.2的試驗(yàn)結(jié)果，選用無水乙醇作為提取溶劑，采用超聲波輔助法和微波加熱輔助手段來提取類胡蘿卜素，并以靜置提取法為對(duì)照。由圖3結(jié)果可以看出，用超聲波輔助法可顯著提高類胡蘿卜素提取率，且超聲波輔助的提取效果好于微波。另外，利用超聲波處理可以提高工作效率。因此初步確定南瓜果肉類胡蘿卜素提取的最佳方法為超聲波輔助法。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

在前面試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取提取過程中的3個(gè)主要影響因子:料液比、浸提時(shí)間和抽提次數(shù)設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)，進(jìn)一步確定南瓜果肉提取類胡蘿卜素的最優(yōu)條件。由表2試驗(yàn)結(jié)果可知，3個(gè)因子對(duì)類胡蘿卜素提取效果的影響次序?yàn)?抽提次數(shù)>料液比>處理時(shí)間。其中抽提次數(shù)對(duì)類胡蘿卜素提取率影響最大，而處理時(shí)間影響最小，由此可見，在超聲波輔助條件下，樣品中的類胡蘿卜素可以快速被浸提出來。由表2的結(jié)果可以看出，處理時(shí)間為8 min和12 min時(shí)，類胡蘿卜素提取率相近，都明顯高于處理時(shí)間為4 min時(shí)的提取率。隨著溶劑量的增加，提取率呈下降趨勢(shì)。因此，南瓜果肉類胡蘿卜素提取的最佳條件為:超聲波輔助下，料液比1∶4，浸提8 min，共抽提4次。

表2 南瓜果肉類胡蘿卜素提取的正交試驗(yàn)組合及結(jié)果

2.5 5個(gè)南瓜品種果實(shí)發(fā)育過程中類胡蘿卜素含量的變化

由圖4可以看出，5個(gè)南瓜品種類胡蘿卜素積累的整體趨勢(shì)一致，隨著成熟度增加，果肉中類胡蘿卜素含量均逐漸增加。但每個(gè)品種的類胡蘿卜素積累規(guī)律各不相同。花后7～14 d，5個(gè)南瓜品種類胡蘿卜素含量均較低，無顯著增加；14 d后，‘迷你荃鑫’‘荃鑫6號(hào)’類胡蘿卜素含量開始顯著增加，而‘綠圓’‘黑晶’‘早豐蜜’類胡蘿卜素含量則從28 d后才開始顯著增加?；ê?8 d各品種類胡蘿卜素含量均進(jìn)入快速增長(zhǎng)期。其中‘荃鑫6號(hào)’‘綠圓’和‘黑晶’在花后49 d類胡蘿卜素的積累趨于穩(wěn)定，果肉中類胡蘿卜素含量無顯著增加。‘迷你荃鑫’和‘早豐蜜’則直到花后56 d仍在顯著增加。5個(gè)品種中類胡蘿卜素含量較高的2個(gè)品種‘迷你荃鑫’和‘黑晶’在早期(7～14 d)含量無顯著差異，從21 d開始‘迷你荃鑫’的類胡蘿卜素含量極顯著高于其他品種。成熟期5個(gè)品種類胡蘿卜素含量依次為:‘迷你荃鑫’>‘黑晶’>‘荃鑫6號(hào)’>‘綠圓’>‘早豐蜜’。不同品種間，南瓜果肉中類胡蘿卜素含量差異明顯。研究結(jié)果表明，不同南瓜品種中類胡蘿卜素的積累規(guī)律存在差異，5個(gè)品種南瓜果肉類胡蘿卜素含量在花后28～49 d均顯著增加，因此推測(cè)，花后28～49 d可能是大多數(shù)南瓜品種類胡蘿卜素合成與積累的關(guān)鍵時(shí)期。測(cè)定的4個(gè)印度南瓜品種類胡蘿卜素含量均高于中國(guó)南瓜。

圖4 不同南瓜品種在不同發(fā)育時(shí)期類胡蘿卜素含量的變化

3 討論與結(jié)論

目前關(guān)于南瓜果肉類胡蘿卜素含量的研究，主要是關(guān)于不同栽培種(中國(guó)南瓜、印度南瓜、美洲南瓜)中類胡蘿卜素含量和種類的差異，或是不同品種成熟期類胡蘿卜素含量的差異，而關(guān)于不同品種不同發(fā)育時(shí)期類胡蘿卜素積累規(guī)律的研究還未見報(bào)道。筆者通過單因素和正交試驗(yàn)篩選出了南瓜果肉類胡蘿卜素的最佳提取溶劑為無水乙醇，與前人研究結(jié)果一致[9]，但與已報(bào)道的南瓜果皮類胡蘿卜素最佳提取工藝不同[10]。利用有機(jī)溶劑浸提類胡蘿卜素，主要是依據(jù)“相似相溶”原理，南瓜果肉與果皮類胡蘿卜素提取的最佳溶劑不同，可能是因?yàn)椴煌课活惡}卜素主要組成類別不同導(dǎo)致的，這需要通過高效液相色譜法進(jìn)一步解析材料中的類胡蘿卜素種類。5個(gè)南瓜品種不同發(fā)育時(shí)期類胡蘿卜素含量變化的結(jié)果表明，同一品種，隨著成熟度的增加，類胡蘿卜素含量顯著增加。類胡蘿卜素含量最高的品種‘迷你荃鑫’，從花后21 d到采收期類胡蘿卜素含量一直顯著增加，在花后49 d進(jìn)入平臺(tái)期，含量無顯著增加。這說明類胡蘿卜素含量高的南瓜品種，果肉類胡蘿卜素的積累不僅開始的時(shí)期較早，而且積累的時(shí)間更長(zhǎng)。南瓜果肉中類胡蘿卜素在花后21 d開始顯著增加，花后28～42 d為快速積累期，這一時(shí)期剛好是南瓜果實(shí)膨大基本完成，開始成熟轉(zhuǎn)色的時(shí)期，也是干物質(zhì)積累的關(guān)鍵時(shí)期。另外不同品種間隨著成熟度的增加，類胡蘿卜素含量差異也在逐漸變大，相同的栽培條件下，不同品種類胡蘿卜素含量差異明顯。說明南瓜中類胡蘿卜素含量的差異主要是由品種不同導(dǎo)致的，生產(chǎn)上需要高類胡蘿卜素含量的南瓜，品種選擇尤為重要?！貊?號(hào)’‘綠圓’和‘黑晶’3個(gè)品種在花后49 d左右類胡蘿卜素的積累趨于穩(wěn)定，‘迷你荃鑫’和‘早豐蜜’直到56 d即果實(shí)采收期類胡蘿卜素仍處于快速積累期，這說明不同類型的南瓜類胡蘿卜素積累規(guī)律存在差異，果實(shí)采摘后適當(dāng)后熟可能利于類胡蘿卜素更充分的積累。近年來，南瓜的保健價(jià)值越來越受到廣大消費(fèi)者的青睞，本研究可以為南瓜保健品開發(fā)、深加工及品質(zhì)育種提供參考。

綜上，南瓜果肉類胡蘿卜素提取的最佳工藝條件為，在超聲波輔助下，利用無水乙醇為提取溶劑，料液比1∶4，浸提8 min，共抽提4次。成熟期5個(gè)品種類胡蘿卜素含量依次為:‘迷你荃鑫’>‘黑晶’>‘荃鑫6號(hào)’>‘綠圓’>‘早豐蜜’。不同南瓜品種中類胡蘿卜素的積累規(guī)律存在差異，5個(gè)品種南瓜果肉類胡蘿卜素含量在花后28～49 d均顯著增加，因此推測(cè)，花后28～49 d可能是大多數(shù)南瓜品種類胡蘿卜素合成與積累的關(guān)鍵時(shí)期。