張 雯，宋俊科，王海港，周啟蒙，王曉波，杜冠華

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 & 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥物研究所，北京市藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050）

靈芝是一種傳統(tǒng)名貴藥材，也是可食用真菌，具有安神益氣、活血益筋、止咳平喘、扶正固本等功效。靈芝孢子是靈芝生長(zhǎng)成熟期從菌蓋彈射出來(lái)的細(xì)小顆粒，富含人體必需氨基酸、糖肽、甾醇、生物堿和三萜類等物質(zhì)，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和保肝降糖等多種功能[1-2]。靈芝孢子有兩層質(zhì)地堅(jiān)硬、耐酸的孢壁，阻礙機(jī)體的消化吸收，因此靈芝孢子需破壁服用[3-4]。

靈芝對(duì)免疫力的調(diào)節(jié)作用已有報(bào)道，但對(duì)破壁前后靈芝孢子粉的作用差異尚缺乏充分的認(rèn)識(shí)。環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide）是醫(yī)學(xué)上常用的抗癌藥，也是常用的免疫抑制劑，可用于建立免疫低下的動(dòng)物模型[5-6]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）測(cè)定破壁與不破壁靈芝孢子粉中靈芝酸A、C2、和D的含量，以環(huán)磷酰胺免疫低下小鼠作為模型動(dòng)物，考察破壁機(jī)處理靈芝孢子粉對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫抑制的調(diào)節(jié)作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

JYL-Y8 PLUS營(yíng)養(yǎng)破壁調(diào)理機(jī)（九陽(yáng)）；JYL-C051料理機(jī)（九陽(yáng)）；Agilent 1200高效液相色譜儀，Agilent 6110單四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent）；CascadaTMLS water純水儀（美國(guó)Pall）；Spectra Max M5酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon）；XS105 DU電子天平（瑞士Mettler Toledo）；Vortex Genie 2渦旋震蕩儀（美國(guó)Scientific Industries）；MiniSpin常溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）。

1.2 材料

靈芝孢子粉（北京協(xié)和藥廠）；環(huán)磷酰胺（山西普德藥業(yè)）；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的CD3+（FITCCD3+），藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記的CD8+（PE-CD8+），藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）-菁類染料（cyanine，Cy5）偶聯(lián)標(biāo)記的CD4+（PE-CY5-CD4+）（美國(guó)BD）；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，胎牛血清（美國(guó)Gibco）；紅細(xì)胞裂解液（碧云天）；噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT），刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA），脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（美國(guó)Sigma Aldrich）；小鼠免疫球蛋白IgG、IgM ELISA試劑盒（武漢華美）。

1.3 動(dòng)物

KM小鼠（SPF級(jí)），雄性，30～32 g[北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002]。飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（No. 00000804），自由攝食飲水，室溫22±1 ℃，相對(duì)濕度55～65%，12 h光照周期。所有動(dòng)物的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程均按照中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的指導(dǎo)方針。

2 方法

2.1 靈芝孢子粉處理

準(zhǔn)確稱取30 g靈芝孢子粉，加400 ml水，用破壁調(diào)理機(jī)處理，轉(zhuǎn)速10級(jí)，時(shí)間20 s/次，共4次。準(zhǔn)確稱取30 g靈芝孢子粉，加400 ml水，用料理機(jī)處理，默認(rèn)轉(zhuǎn)速，時(shí)間20 s/次，共4次。分別得破壁靈芝孢子粉混懸液和非破壁靈芝孢子粉混懸液。

2.2 破壁與非破壁靈芝孢子粉離心后沉淀重量比較

離心管稱重，分別加入破壁及非破壁處理的靈芝孢子粉混懸液5 ml，稱重，1000 r/min離心10 min，棄上清，再次稱重，計(jì)算沉淀重量。

2.3 化合物檢測(cè)

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl，檢測(cè)波長(zhǎng)288 nm，流動(dòng)相為0.02%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），采用負(fù)離子檢測(cè)模式，分別采用全掃描模式和單離子監(jiān)測(cè)模式對(duì)潛在化合物靈芝酸A、C2、D進(jìn)行預(yù)測(cè)。

質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)為碎裂電壓150 V，增益1.5，干燥氣流速度10.0 L/min，噴霧氣壓力35 psig，干燥氣溫度350 ℃，毛細(xì)管電壓 3000 V（正模式），3000 V（負(fù)模式）。單離子監(jiān)測(cè)模式監(jiān)測(cè)的m/z見(jiàn)表2。

表2 單離子監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)的離子m/z和對(duì)應(yīng)的目標(biāo)化合物

2.4 模型制備及分組

昆明小鼠80只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、非破壁靈芝孢子粉組（750 mg/kg）和破壁靈芝孢子粉組（750 mg/kg）。除正常對(duì)照組外其余3組腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg，連續(xù)注射3 d。從第4天起開(kāi)始給藥，各給藥組每天灌胃給予相應(yīng)的藥物溶液，10 ml/kg，每天1次，連續(xù)28 d。正常對(duì)照組和模型組給予等容積的滅菌水。

2.5 自主活動(dòng)測(cè)定

將小鼠放入自主活動(dòng)箱中，測(cè)定前每只小鼠先適應(yīng)環(huán)境1 min，再由記錄儀自動(dòng)記錄3 min內(nèi)小鼠自發(fā)活動(dòng)次數(shù)。

2.6 免疫球蛋白及T細(xì)胞亞群測(cè)定

采用ELISA法測(cè)定血清IgG和IgM水平。每只小鼠取全血樣50 μl，加入紅細(xì)胞裂解液500 μl，然后輕輕吹打均勻，2 min后800 r/min離心5 min，棄去上層紅色液體，離心洗滌兩次。加入50 μl生理鹽水重懸后分別加入CD3+、CD4+、CD8+抗體各1 μl，室溫下避光靜置15 min，加入450 μl生理鹽水輕吹混勻，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.7 骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定

取小鼠一側(cè)完整股骨，除凈軟組織，用PBS將全部骨髓沖洗至離心管，過(guò)200目細(xì)胞篩，定容至5 ml。計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并計(jì)算絕對(duì)數(shù)量[7]。

2.8 免疫器官指數(shù)及淋巴細(xì)胞增殖的測(cè)定

無(wú)菌取脾和胸腺，清洗血跡并吸干水分，稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。置于2 ml RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，200目細(xì)胞篩中研磨，收集細(xì)胞，后加入10 ml PBS，1000 r/min離心10 min，重復(fù)兩次。棄去上層溶液，加入6 ml紅細(xì)胞裂解液，吹打均勻，1500 r/min離心10 min，棄去上層溶液。加3 ml RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打均勻。以含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，鋪96孔板。設(shè)置加刺激組和對(duì)照組，刺激組加入ConA（終濃度為5 μg/ml）或LPS（終濃度為10 μg/ml），對(duì)照組加入等體積RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液。48 h后MTT染色，計(jì)算T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞相對(duì)增殖指數(shù)。

2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

3 結(jié)果

3.1 破壁與非破壁處理靈芝孢子粉離心后沉淀物重量比較

破壁靈芝孢子粉的沉淀重量較不破壁靈芝孢子粉的沉淀重量輕（P＜0.05），表明經(jīng)破壁處理的靈芝孢子粉有更多物質(zhì)混懸到溶液中，導(dǎo)致其沉淀重量較輕，見(jiàn)表3。

表3 破壁與非破壁處理靈芝孢子粉懸液離心后沉淀重量比較（±s，n=6）

表3 破壁與非破壁處理靈芝孢子粉懸液離心后沉淀重量比較（±s，n=6）

注：*P＜0.05 vs 非破壁組

非破壁/mg 破壁/mg 1180.7±141.1 1012.7±59.6*

3.2 HPLC-MS比較破壁與非破壁靈芝孢子粉中化合物含量差別

結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，破壁靈芝孢子粉中靈芝酸A、C2、D的釋放量顯著高于非破壁靈芝孢子粉中的釋放量（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）。

表4 破壁與不破壁靈芝孢子粉中靈芝酸A、C2、D相對(duì)含量比較（±s，n=6）

表4 破壁與不破壁靈芝孢子粉中靈芝酸A、C2、D相對(duì)含量比較（±s，n=6）

注：***P＜0.001 vs 非破壁組

非破壁組相對(duì)含量/% 破壁組相對(duì)含量/%靈芝酸A 98.41±4.96 116.54±3.47***靈芝酸C2 97.70±5.92 110.13±10.34***靈芝酸D 103.44±7.55 117.76±2.25***

3.3 靈芝孢子粉對(duì)小鼠存活率的影響

連續(xù)統(tǒng)計(jì)31 d內(nèi)各組小鼠死亡情況，模型動(dòng)物死亡率為35%（7/20），非破壁靈芝孢子粉治療組動(dòng)物死亡率為25%（5/20），破壁靈芝孢子粉治療組動(dòng)物死亡率為20%（4/20），破壁與非破壁靈芝孢子粉組動(dòng)物死亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4 靈芝孢子粉對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響

測(cè)定各組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 小鼠自主活動(dòng)次數(shù)（n=10）

3.5 靈芝孢子粉對(duì)小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響

結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可見(jiàn)，與正常組相比，模型組小鼠胸腺、脾萎縮變小，胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均顯著降低（P＜0.001，P＜0.001）。與模型組相比，破壁靈芝孢子粉給藥治療組胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.01）。非破壁靈芝孢子粉給藥治療組胸腺指數(shù)與模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明破壁靈芝孢子粉給藥治療能顯著提高免疫低下小鼠的胸腺指數(shù)，非破壁給藥組無(wú)此作用。兩個(gè)給藥治療組脾指數(shù)均有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 胸腺、脾臟指數(shù)（±s，n=6）

表5 胸腺、脾臟指數(shù)（±s，n=6）

注：###P＜0.001 vs 對(duì)照組；**P＜0.01 vs 模型組

胸腺指數(shù) 脾指數(shù)對(duì)照組 1.49±0.42 5.12±0.76模型組 0.66±0.27### 3.54±0.88###非破壁組（750 mg/kg） 0.89±0.29 3.71±0.56破壁組（750 mg/kg） 1.05±0.34** 3.94±0.86

3.6 破壁靈芝孢子粉增加小鼠骨髓有核細(xì)胞

結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，模型組股骨有核細(xì)胞絕對(duì)數(shù)值顯著降低（P＜0.001）。與模型組相比，破壁靈芝孢子粉給藥治療能顯著提高股骨有核細(xì)胞絕對(duì)數(shù)值（P＜0.05）。非破壁靈芝孢子粉給藥治療對(duì)骨髓有核細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著影響。說(shuō)明破壁靈芝孢子粉的治療作用優(yōu)于非破壁靈芝孢子粉。

表6 骨髓有核細(xì)胞絕對(duì)數(shù)值（ ±s，n=6）

表6 骨髓有核細(xì)胞絕對(duì)數(shù)值（ ±s，n=6）

注：###P＜0.001 vs 對(duì)照組；*P＜0.05 vs 模型組

骨髓有核細(xì)胞數(shù)（×106）對(duì)照組 13.18±1.81模型組 6.8±1.35###非破壁組（750 mg/kg） 8.57±0.86破壁組（750 mg/kg） 9.17±1.23*

3.7 靈芝孢子粉對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的作用

結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可見(jiàn)，與正常組相比，模型組的刺激指數(shù)均顯著降低（P＜ 0.001），即腹腔注射環(huán)磷酰胺能顯著抑制機(jī)體T、B淋巴細(xì)胞的增殖。與模型組相比，破壁與非破壁靈芝孢子粉治療均能顯著提高T淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)（P＜0.05，P＜0.05）。破壁靈芝孢子粉能顯著提高B淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)（P＜0.01）。非破壁靈芝孢子粉給藥治療對(duì)B淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)無(wú)顯著影響。

表7 淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)（±s，n=6）

表7 淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)（±s，n=6）

注：###P＜0.001 vs 對(duì)照組；*P＜0.05，**P＜0.01 vs 模型組

T淋巴細(xì)胞增殖指數(shù) B淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)對(duì)照組 0.8±0.09 0.38±0.03模型組 0.31±0.05### 0.1±0.03###非破壁組（750 mg/kg） 0.46±0.09* 0.15±0.03破壁組（750 mg/kg） 0.47±0.08* 0.19±0.06**

3.8 破壁靈芝孢子粉調(diào)節(jié)外周血中T細(xì)胞亞群

結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺可顯著下調(diào)CD3+和CD4+T細(xì)胞亞群的比例（P＜0.001，P＜0.01），降低CD4+/CD8+T細(xì)胞比值（P＜0.001），上調(diào)CD8+T細(xì)胞亞群的比例（P＜0.01）。與模型組相比，破壁靈芝孢子粉給藥治療能顯著抑制CD3+、CD4+的降低（P＜0.001，P＜0.01），顯著降低環(huán)磷酰胺所致CD8+（P＜0.01）的升高，調(diào)節(jié)CD4+/CD8+T細(xì)胞比值（P＜0.01）。非破壁靈芝孢子粉給藥組CD3+的比例和CD4+/CD8+的比值均顯著低于破壁處理組（P＜0.01，P＜0.05）。

表8 外周血中T細(xì)胞亞群（ ±s，n=6）

表8 外周血中T細(xì)胞亞群（ ±s，n=6）

注：##P＜0.01，###P＜0.001 vs 對(duì)照組；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs 模型組；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs 破壁組

CD3+/% CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+對(duì)照組 72.19±5.23 64.52±5.06 19.77±1.01 3.26±0.90模型組 53.52±4.49### 43.39±5.50## 30.41±2.00## 1.44±0.48###非破壁組（750 mg/kg） 56.83±4.04&& 50.87±6.73 26.15±3.56 1.95±0.52&破壁組（750 mg/kg） 66.13±4.25*** 61.32±3.59** 21.78±1.74** 2.83±0.24**

3.9 破壁靈芝孢子粉增加血清中IgG和IgM的含量

結(jié)果見(jiàn)表9。由表9可見(jiàn)，環(huán)磷酰胺模型組小鼠血漿免疫球蛋白IgG和IgM水平均顯著低于對(duì)照組（P＜0.001，P＜0.001）。與模型組相比，非破壁靈芝孢子粉能提高小鼠血清中IgM的含量（P＜0.05），對(duì)小鼠血清中IgG含量沒(méi)有明顯影響。破壁靈芝孢子粉治療組能顯著提高IgG（P＜0.05）和IgM（P＜0.01）的水平。

表9 血清中免疫球蛋白IgG和IgM的含量（±s，n=6）

表9 血清中免疫球蛋白IgG和IgM的含量（±s，n=6）

注：###P＜0.001 vs 對(duì)照組；*P＜0.05，**P＜0.01 vs 模型組

IgG IgM對(duì)照組 1297.5±236.18 615.67±35.46模型組 602.33±244.57###309.67±64.49###非破壁組（750 mg/kg） 882.8±128.2 414.27±65.05*破壁組（750 mg/kg） 925.19±93.35* 468.49±80.16**

4 討論與結(jié)論

靈芝孢子有兩層耐酸堿的堅(jiān)硬壁狀結(jié)構(gòu)，只有經(jīng)過(guò)破壁的靈芝孢子才利于人體吸收利用，發(fā)揮其藥理活性，尤其是免疫活性[3-4]。靈芝酸A、靈芝酸C2和靈芝酸D均是三萜類物質(zhì)，是靈芝中的主要活性化合物。但靈芝孢子的破壁目前除了工業(yè)化處理外，尚沒(méi)有簡(jiǎn)易的方法，使靈芝孢子的應(yīng)用受到限制，也導(dǎo)致大量靈芝孢子雖被使用，但沒(méi)有發(fā)揮相應(yīng)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用破壁機(jī)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)靈芝孢子的破壁，使其釋放更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中破壁靈芝孢子粉中的靈芝酸A、靈芝酸C2和靈芝酸D均顯著高于非破壁靈芝孢子粉中的對(duì)應(yīng)物質(zhì)。

免疫是指機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別自身與異己物質(zhì)，并通過(guò)免疫應(yīng)答排除抗原性異物，以維持機(jī)體生理平衡的功能[8-9]。目前，人們普遍認(rèn)為機(jī)體的健康狀況及壽命的長(zhǎng)短與免疫功能息息相關(guān)。當(dāng)機(jī)體免疫功能下降或受抑制時(shí)，不能有效地識(shí)別并清除突變的細(xì)胞及外來(lái)細(xì)菌、病毒等，腫瘤及感染性疾病發(fā)生率增高[10-12]。因此，提高自身免疫力成了人們關(guān)注的話題，開(kāi)發(fā)安全的具有免疫增強(qiáng)作用的功能性食品成為研究熱點(diǎn)[13-16]。

環(huán)磷酰胺是較強(qiáng)的烷化劑，可引起骨髓造血抑制和免疫抑制。實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔注射80 mg/kg環(huán)磷酰胺后，小鼠存活率顯著降低，免疫器官萎縮變小，股骨有核細(xì)胞絕對(duì)數(shù)值顯著降低，脾臟、胸腺的T、B淋巴細(xì)胞活性均受到不同程度抑制，且免疫球蛋白IgG和IgM含量降低。由此可見(jiàn)應(yīng)用環(huán)磷酰胺腹腔注射小鼠造成免疫功能低下模型，可用來(lái)觀察不同破壁模式下靈芝孢子粉對(duì)免疫功能的影響。

連續(xù)28 d分別灌胃給予兩組實(shí)驗(yàn)小鼠破壁靈芝孢子粉和非破壁靈芝孢子粉（750 mg/kg）。與模型組相比，破壁靈芝孢子粉給藥治療組能提高小鼠存活率，顯著提高小鼠胸腺指數(shù)，股骨有核細(xì)胞絕對(duì)數(shù)值顯著升高，且能顯著抑制環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化率的降低，顯著提高小鼠血漿免疫球蛋白IgG和IgM水平。與模型組相比，非破壁靈芝孢子粉給藥治療對(duì)小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、股骨有核細(xì)胞數(shù)、B淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化率、免疫球蛋白IgG均無(wú)顯著影響，僅能有效抑制環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的T淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化率的降低、顯著提高小鼠血漿免疫球蛋白IgM水平。

T淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，在體內(nèi)參與特異性免疫，它不僅是細(xì)胞免疫功能的承擔(dān)者，也是免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)者。其中CD3+包括外周所有成熟T細(xì)胞，代表細(xì)胞免疫的總體水平[12,17]。CD4+細(xì)胞代表輔助/誘導(dǎo)性T細(xì)胞（Th），CD8+細(xì)胞代表抑制/殺傷性T細(xì)胞（Ts），二者在體內(nèi)維持一定的比例，共同參與免疫應(yīng)答過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中，磷酰胺可顯著下調(diào)CD3+和CD4+T細(xì)胞亞群的比例，降低CD4+/CD8+T細(xì)胞比值，上調(diào)CD8+T細(xì)胞亞群的比例。破壁靈芝孢子粉給藥治療組能調(diào)節(jié)免疫低下小鼠的淋巴細(xì)胞比例，對(duì)細(xì)胞免疫功能有恢復(fù)作用。

以上結(jié)果顯示，經(jīng)破壁處理的靈芝孢子粉對(duì)小鼠的免疫功能有較明顯的促進(jìn)作用，與非破壁靈芝孢子粉相比，作用明顯增強(qiáng)。這為免疫力低下患者提供了一種行之有效的中藥有效成分食用方法。