徐傳濤,彭 勇,謝 強(qiáng),屈 旭,馮 超

(1.四川省煙草公司瀘州市公司，四川瀘州646000；2.青島中煙種子有限責(zé)任公司，山東青島266100；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙草行業(yè)煙草病蟲(chóng)害監(jiān)測(cè)與綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266101)

煙草黑脛病是煙葉生產(chǎn)最具毀滅性的病害之一。煙草黑脛病是由煙草黑脛病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)引起的土傳病害。我國(guó)煙草黑脛病初見(jiàn)于1919年,由澤田兼吉撰寫(xiě)的“臺(tái)灣產(chǎn)菌類調(diào)查報(bào)告”中(朱賢朝等,2002),20世紀(jì)40年代,病區(qū)擴(kuò)展到黃河、長(zhǎng)江以及珠江流域的各煙草產(chǎn)區(qū),對(duì)當(dāng)?shù)責(zé)熑~生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。20世紀(jì)70年代后期到80年代末期,由于大量種植感病品種、煙田連作導(dǎo)致此病嚴(yán)重流行(陳瑞泰等,1997)。

丁吡嗎啉[E-3-(2-氯吡啶-4)-基]-丙烯酰嗎啉是由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)與中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所共同開(kāi)發(fā)的新型殺菌劑,其對(duì)致病疫霉(Phytophthora infestans)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)等重要植物病原菌均具有很好的抑制作用(陳小霞等,2007),但丁吡嗎啉對(duì)煙草黑脛病生物學(xué)特性的影響未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)測(cè)定丁吡嗎啉對(duì)煙草黑脛病菌毒力及其對(duì)煙草黑脛病菌產(chǎn)孢力、菌絲生長(zhǎng)及繼代培養(yǎng)菌敏感性的影響,探究丁吡嗎啉對(duì)煙草黑脛病生物學(xué)特性的影響,以期為丁吡嗎啉防治煙草黑脛病的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試藥劑：丁吡嗎啉(Pyrimorph,有效成分96%)原藥,中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院提供。

供試菌株：煙草黑脛病菌(0號(hào)小種)(Phytophtora parasitica var.nicotianae)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。

供試培養(yǎng)基：燕麥培養(yǎng)基,將30 g燕麥于蒸餾水中煮沸,過(guò)濾,濾液中加入18 g瓊脂,蒸餾水定容至1 000 mL,120℃滅菌20 min,冷卻備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙草黑脛病菌對(duì)丁吡嗎啉的敏感性 用菌絲生長(zhǎng)速率法(方中達(dá),1998)測(cè)定煙草黑脛病菌對(duì)丁吡嗎啉的敏感性。在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制率在10%-90%的藥劑濃度。先將試驗(yàn)藥劑用DMSO溶液配制成10 000 mg·L-1母液,后用DMSO梯度稀釋至1 000、500、100、50、10 mg·L-1。按體積比為1∶100的比例分別加入到融化后的培養(yǎng)基中,并充分混合均勻,倒入? ＝9 cm培養(yǎng)皿內(nèi)制成含有系列濃度藥劑的含藥平板,以加入等體積DMSO的燕麥培養(yǎng)基平板為對(duì)照。采用? ＝5 mm的打孔器打取菌落邊緣生長(zhǎng)狀況一致的菌餅,菌絲面向下接種于已經(jīng)冷卻的含藥燕麥培養(yǎng)基中央,置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)5 d。在自動(dòng)菌落分析儀下采用十字交叉的方法測(cè)定供試菌株在不同濃度藥劑條件下的菌落直徑,與對(duì)照菌落比較計(jì)算各濃度藥劑對(duì)菌落大小的抑制率,比較不同濃度藥劑對(duì)供試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。所得數(shù)據(jù)經(jīng)DPS統(tǒng)計(jì)軟件求出毒力回歸方程及EC50值。

1.2.2 丁吡嗎啉對(duì)煙草黑脛病菌產(chǎn)孢力的影響 用1.2.1中的方法,配制濃度為0、0.5、1、2、5、10、20 mg·L-1的加藥平板,同樣將接種的平板黑暗培養(yǎng)5 d后,用?＝5 mm的打孔器分別打取各濃度菌落邊緣的菌餅6片,置于無(wú)菌的?＝9 cm培養(yǎng)皿內(nèi),皿內(nèi)加入5 mL的無(wú)菌水潤(rùn)濕菌絲。在恒溫培養(yǎng)箱中26℃培養(yǎng)3 d誘導(dǎo)產(chǎn)生孢子,然后取100 μL溶液,采用血球計(jì)數(shù)法在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)計(jì)數(shù)室,統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)量,以無(wú)丁吡嗎啉作對(duì)照,計(jì)算丁吡嗎啉對(duì)煙草黑脛病菌的產(chǎn)孢抑制率(Matheron et al.,2000)。

產(chǎn)孢抑制率(%)＝(對(duì)照孢子數(shù)量-處理孢子數(shù)量)/對(duì)照孢子數(shù)量×100

1.2.3 丁吡嗎啉對(duì)煙草黑脛病菌絲生長(zhǎng)量的影響 在100 mL的錐形瓶?jī)?nèi)加入50 mL液體燕麥培養(yǎng)基滅菌備用,從活化好的燕麥培養(yǎng)基上的煙草黑脛病菌落邊緣打取? ＝5 mm菌餅,分別接入備用的燕麥液體培養(yǎng)基內(nèi),每瓶3片菌餅。搖床內(nèi)培養(yǎng)14 d后,在瓶?jī)?nèi)分別加入供試藥劑使丁吡嗎啉最終濃度為2、5、10、20 mg·L-1；繼續(xù)培養(yǎng)7 d后將培養(yǎng)液抽濾去除,每個(gè)菌絲團(tuán)用無(wú)菌水沖洗3-4次,于60℃烘箱內(nèi)烘烤24 h后,稱量含有菌絲的濾紙干重。求出菌絲干重,并計(jì)算抑制率。每個(gè)處理重復(fù)3次(秦維彩,2010)。

菌絲生長(zhǎng)量抑制率(%)＝(對(duì)照菌絲干重-處理菌絲干重)/對(duì)照菌絲干重×100

1.2.4 繼代培養(yǎng)的煙草黑脛病菌對(duì)丁吡嗎啉敏感性的影響 菌株在含有丁吡嗎啉的濃度為2和5 mg·L-1的培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)至第5代,然后取F0,F3,F5代的培養(yǎng)物分別置于含有系列濃度丁吡嗎啉的含毒培養(yǎng)基上,26℃培養(yǎng)5 d后測(cè)量菌落直徑,以F0代不加藥劑做為對(duì)照,每處理重復(fù)4次,計(jì)算EC50值并進(jìn)行比較(袁宗勝等,2001)。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁吡嗎啉對(duì)煙草黑脛病菌的毒力

丁吡嗎啉對(duì)煙草黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)速率的抑制回歸方程為Y＝1.9213X+4.3457(相關(guān)系數(shù)r＝0.99),室內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明,丁吡嗎啉對(duì)煙草黑脛病菌的EC50值為2.19 mg·L-1,95%置信限為1.68-2.93 mg·L-1。

2.2 丁吡嗎啉對(duì)煙草黑脛病菌產(chǎn)孢的影響

由表1可以看出,當(dāng)丁吡嗎啉濃度為0.5和1 mg·L-1時(shí),對(duì)煙草黑脛病的孢子囊形成抑制率分別為39.5%和60.5%,處于較低的水平。但當(dāng)丁吡嗎啉濃度達(dá)到2 mg·L-1時(shí),其對(duì)煙草黑脛病菌的產(chǎn)孢抑制率可達(dá)81.4%,濃度變大后孢子囊形成抑制率也變大。丁吡嗎啉對(duì)煙草黑脛病孢子形成的EC50為0.66 mg·L-1,毒力線性回歸方程是：Y＝1.4529X+5.2609(r＝0.988)。相較于丁吡嗎啉對(duì)煙草黑脛的菌絲抑制效果要顯著。

表1 丁吡嗎啉對(duì)煙草黑脛病孢子形成的影響Table 1 Effect of pyrimorph on the sporulation of Phytophthora parasitica var.nicotianae

2.3 丁吡嗎啉對(duì)煙草黑脛病菌絲生長(zhǎng)量的影響

由表2可以看出,丁吡嗎啉的濃度與對(duì)煙草黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)量的抑制率成正相關(guān)性,隨著丁吡嗎啉藥劑濃度的變大其對(duì)煙草黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)量的抑制越大。試驗(yàn)中最高丁吡嗎啉濃度為20 mg·L-1時(shí),對(duì)生長(zhǎng)量的抑制率為(77.6±4.3)%,最藥劑濃度2 mg·L-1時(shí),對(duì)菌絲生長(zhǎng)量的抑制率為(17.4±3.1)%。毒力回歸方程為Y＝1.7886X+3.4307,相關(guān)系數(shù) r＝0.9809,EC50為 7.53 mg·L-1。

表2 丁吡嗎啉對(duì)煙草黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)量的影響Table 2 Effect of pyrimorph on the mycelial growth of Phytophthora parasitica var.nicotianae

2.4 繼代培養(yǎng)的煙草黑脛病菌對(duì)丁吡嗎啉敏感性的影響

由表3可知,煙草黑脛病菌經(jīng)繼代培養(yǎng)后對(duì)丁吡嗎啉的耐藥性均有不同程度的增加,并隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加其耐藥性也在增加。在5 mg·L-1條件下培養(yǎng)的黑脛病菌株,F0代對(duì)丁吡嗎啉的 EC50為2.19 mg·L-1,而經(jīng)過(guò)三代培養(yǎng)后 F3代對(duì)丁吡嗎啉的 EC50增長(zhǎng)為 2.38 mg·L-1,五代培養(yǎng)后F5丁吡嗎啉的EC50增長(zhǎng)為3.33 mg·L-1。2 mg·L-1條件下五代培養(yǎng)后F5丁吡嗎啉的EC50增長(zhǎng)為4.41 mg·L-1,明顯高于5 mg·L-1條件下的EC50,可能原因?yàn)閮芍昃陮?duì)丁吡嗎啉的敏感性產(chǎn)生了明顯的分化。由此可知黑脛病菌株在煙草黑脛病的繼代培養(yǎng)過(guò)程中,菌株對(duì)丁吡嗎啉的敏感性在逐漸降低,即煙草黑脛病對(duì)丁吡嗎啉抗性風(fēng)險(xiǎn)的增加是隨著丁吡嗎啉施用代數(shù)的增加緩慢增加。

表3 煙草黑脛病菌繼代培養(yǎng)菌對(duì)丁吡嗎啉的敏感性Table 3 Sensitivity of the subculture of Phytophthora parasitica var.nicotianae to pyrimorph

3 結(jié)論與討論

煙草黑脛病防治措施主要有：種植抗病品種,加強(qiáng)田間管理,化學(xué)藥劑防治,生物藥劑防治等(Lucas,1975；Shew,1984)。其中抗病品種多因“抗性基因變異或喪失”而失去抗病性,而化學(xué)防治是防治煙草黑脛病最經(jīng)濟(jì)有效的手段,特別是在病害大流行的時(shí)期(汪漢成等,2011)。常見(jiàn)的用于防治煙草黑脛病的化學(xué)藥劑有：甲霜靈,烯酰嗎啉,霜霉威,三乙磷酸鋁,代森錳鋅,甲霜靈·錳鋅等。但由于甲霜靈、甲霜靈·錳鋅等藥劑的長(zhǎng)期使用已經(jīng)產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性(袁宗勝等,2001),為此亟待解決防治煙草黑脛病藥劑的替代問(wèn)題。

試驗(yàn)結(jié)果表明,丁吡嗎啉對(duì)煙草黑脛病菌菌絲生速率、孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)量均具有良好的抑制效果。結(jié)合目前的生產(chǎn)實(shí)際在煙草黑脛病的防治過(guò)程中可以通過(guò)以下三種方式提高防治效果：(1)抗病品種與化學(xué)藥劑相結(jié)合,可以減少使用化學(xué)藥劑的次數(shù)和降低病原菌抗藥性的產(chǎn)生；(2)丁吡嗎啉與其他常見(jiàn)殺菌劑交替使用,合理用藥；(3)將丁吡嗎啉與非內(nèi)吸性保護(hù)劑及其他的殺菌劑混配使用。