向 雙,陳澤明,張曉華,鄒雙全

(福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心，福建福州350002)

圓齒野鴉椿(Euscaphis konishii Hayata),屬省沽油科(Staphyleaceae)野鴉椿屬(Euscaphis),是我國特有的常綠小喬木。廣泛分布在福建、江西、浙江等地。其樹形優(yōu)美,果實通紅亮麗,是一種優(yōu)良的觀賞樹種,在園林上可群植、片植,亦可作為觀賞樹和行道樹等。同時,圓齒野鴉椿是一種民間傳統(tǒng)藥用植物(敖小朋等,2009),可抗炎陣痛(董玫等,2004)、抗腫瘤(左敏等,2008)、殺蟲殺菌等,其根、花、果實可入藥。

黃酮類化合物是廣泛存在于藥用植物中的一類化合物,鄒小興等人(2016)采用系統(tǒng)預(yù)試法對圓齒野鴉椿葉及枝條化學(xué)成分進行預(yù)試驗,結(jié)果表明,圓齒野鴉椿葉及枝條可能含有黃酮類、生物堿、皂苷、醌類等化學(xué)成分。黃酮類化合物可以抑制或誘發(fā)一些與重要酶促反應(yīng)有關(guān)的酶的生成,如免疫響應(yīng)、解毒、消炎、調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和繁殖等(陳建琴等,2010)。黃酮的提取方法有很多,曹洪斌等(2017)在杜仲總黃酮提取里用了水提法、溶劑提取法、超聲提取法、微波提取法、酶提取法以及半仿生法。傳統(tǒng)提取法存在提取率低,雜質(zhì)多等問題,而超聲波提取法比起傳統(tǒng)的熱回流提取方法更為簡便快捷,黃酮提取率更高(崔瑩,2017)。本次試驗采用超聲波法提取圓齒野鴉椿葉片中總黃酮,通過正交試驗對料液比、乙醇濃度、超聲波功率、提取時間四個因素進行考察研究,確定出圓齒野鴉椿葉片總黃酮超聲波提取的最優(yōu)工藝條件,并測出總黃酮提取率,以期為圓齒野鴉椿總黃酮研究提供參考,有利于更深入地挖掘圓齒野鴉椿的藥用價值,為今后對圓齒野鴉椿的生理保健作用的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

圓齒野鴉椿樣品采于福建省邵武市將石自然保護區(qū),取一年生枝的枝頂葉片。

1.2 試驗方法

1.2.1 建立蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置：將蘆丁對照品置于烘箱105℃干燥至恒重,精密稱取10 mg于100 mL小燒杯中,用70%乙醇溫?zé)崛芙?冷卻至常溫,然后轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中,并用70%乙醇定容,搖勻。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確吸取0(不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液,作為參比)、1、2、3、4、5 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液放置于25 mL的容量瓶中,加入5%NaNO2溶液1 mL,搖勻,放置6 min；加入10%的Al3(NO3)溶液1 mL,搖勻后放置6 min；加入5%的NaOH溶液10 mL,用乙醇定容至刻度,搖勻,放置15 min。按照分光光度法在510 nm波長處測定其吸光度,以加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為縱坐標(biāo),相應(yīng)的吸光值為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 單因素試驗 稱取5份經(jīng)60℃干燥后粉碎過40目篩的圓齒野鴉椿葉片粉末,各1 g,在料液比分別為1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40,、1 ∶50,乙醇濃度分別為 50%、60%、70%、80%、90%,超聲波功率分別為 150、175、200、225、250 W,提取時間分別為 15、20、25、30、35 min 的條件下進行單因素試驗,測定吸光值,計算黃酮提取率。每次試驗重復(fù)3次,以料液比、乙醇濃度、超聲波功率、提取時間對超聲波提取圓齒野鴉椿葉片總黃酮的影響進行研究。

1.2.3 正交試驗 根據(jù)單因素試驗的結(jié)果,以料液比、超聲波功率、乙醇濃度和超聲時間為四個考查因素,分別選取3個水平按L9(34)進行正交試驗設(shè)計(表1)。

表1 超聲波提取法正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test by ultrasonic extraction

1.2.4 總黃酮提取率的計算 圓齒野鴉椿葉片黃酮提取率的計算公式為

式中：A為吸光值；d為提取液稀釋倍數(shù)；V為提取液體積；m為圓齒野鴉椿葉片質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS statistics 19軟件,對試驗數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液為參比,按照分光光度法在510 nm波長條件下測定其吸光度,得到直線回歸方程為Y＝0.1050A-0.0004(R2＝0.9995),表明蘆丁濃度在0.01-0.04 mg·L-1內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Rutin standard curve

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 料液比對提取率的影響研究 從圖2可以看出,圓齒野鴉椿葉片黃酮的提取率隨料液比的增大而呈現(xiàn)出先升高后逐漸下降的趨勢,且提取率在料液比1∶30時達到最大。因此將正交試驗中料液比的三個水平設(shè)定為1∶20,1∶30,1∶40。

2.2.2 乙醇濃度對黃酮提取率的影響 從圖3中可以看出,圓齒野鴉椿葉片黃酮的提取率隨著乙醇濃度的升高而表現(xiàn)出先升高后緩慢下降的趨勢,且提取率在乙醇濃度為70%時達到最大值。因此將正交試驗中的乙醇濃度設(shè)定為60%,70%,80%。

圖2 料液比對總黃酮提取率的影響Figure 2 Effect of the ratio of solid extract to liquid extract on the extraction rate of total flavonoids

圖4 超聲波功率對總黃酮提取率的影響Figure 4 Influence of ultrasonication power on the extraction rate of total flavonoids

圖3 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Figure 3 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

圖5 提取時間對總黃酮提取率的影響Figure 5 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

2.2.3 超聲波功率對黃酮提取率的影響 從圖4中可以看出,隨超聲波功率的增大,圓齒野鴉椿葉片黃酮的提取率先升高后降低,在超聲波功率為200 W時達到最大值。因此將正交試驗中超聲波功率的影響因素水平設(shè)置為175、200、225 W。

2.2.4 超聲波時間對黃酮提取率的影響 從圖5中可以看出,隨提取時間的增加,圓齒野鴉椿葉片總黃酮的提取率先不斷升高,在提取時間為30 min時達到最大,隨后開始下降。因此將正交試驗設(shè)計中的超聲時間水平定為25、30、35 min。

2.3 正交試驗結(jié)果

在上述料液比、乙醇濃度、超聲波功率、超聲波時間四個單因素試驗的基礎(chǔ)上,得到超聲波提取圓齒野鴉椿總黃酮正交試驗所需要的因素。從表2可以看出,影響總黃酮提取率的因素大小順序是提取時間＞料液比＞乙醇濃度＞超聲波功率,確定A1B3C2D3是圓齒野鴉椿葉片總黃酮提取的最佳方案,即料液比為1∶20,乙醇濃度為80%,超聲波功率為200 W,超聲波時間為35 min。

對試驗結(jié)果進行方差分析,結(jié)果如表3所示,四個因素對圓齒野鴉椿黃酮提取率影響均達到極顯著。說明該試驗結(jié)果合理,設(shè)計可靠。

表2 超聲波提取法正交試驗結(jié)果Table 2 Result of orthogonal test for ultrasonic extraction

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 1 Results of orthogonal test subjected to analysis of variance

2.4 重復(fù)性試驗

按照優(yōu)選的組合A1B3C2D3進行5次重復(fù)性試驗,結(jié)果表明,黃酮的平均提取率為3.77%,比正交試驗中的任何一組都好,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.76%,表明該工藝穩(wěn)定。

3 小結(jié)與討論

由于超聲波輔助提取法相較于傳統(tǒng)方法,具有方便快捷,提取率高的特點(禚同友,2015),因此在黃酮提取上廣泛運用。董蘭嵐等(2017)用超聲法提取黃桷樹葉的總黃酮,段志芳等(2007)對溪黃草進行超聲提取總黃酮,方蘭等(2017)對金線草總黃酮進行超聲提取,但目前尚未見到有關(guān)圓齒野鴉椿黃酮提取工藝的研究。本試驗得出超聲波提取圓齒野鴉椿葉片總黃酮的最優(yōu)條件是,料液比1∶20,乙醇濃度80%,超聲波功率200 W,超聲波時間35 min,四個因素中對于圓齒野鴉椿葉片總黃酮提取影響最大的是超聲時間。從大量有關(guān)黃酮提取的研究結(jié)果(李志霞等,2010；羅磊等,2017)來看,不同物質(zhì)的最佳提取工藝會有不同,提取率高低也不一樣。其中,料液比1∶20是常見的最佳條件,乙醇濃度70%為黃酮提取的最佳濃度,可以為相關(guān)試驗提供參考。但在具體試驗中,可能因試驗材料的不同產(chǎn)生誤差,所以還應(yīng)根據(jù)實際情況確定相應(yīng)的試驗條件。本次試驗對圓齒野鴉椿黃酮的提取方法進行了研究,希望可以為后續(xù)對黃酮類化合物的分離純化以及生理活性等研究提供參考,以期為圓齒野鴉椿的深入研究和利用奠定基礎(chǔ)。