竇磊，龐曉燕，李奇，尚海，張頤

（1. 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽 110001；2. 遼寧省腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科，沈陽 110042）

卵巢癌是女性常見惡性腫瘤，其發(fā)病率高，死亡率占各類婦科腫瘤首位。由于就診時卵巢癌患者多為晚期，卵巢癌5年生存率僅約30%。盡管近年化療取得重要進(jìn)展，但卵巢癌5年生存率無明顯提高［1］。目前認(rèn)為上皮性卵巢癌的組織學(xué)起源具有多樣性，遺傳因素和環(huán)境因素等導(dǎo)致的基因突變，機(jī)體內(nèi)分泌激素、生長因子等的異常分泌，均可導(dǎo)致上皮性卵巢癌［2］。因此，研究導(dǎo)致上皮性卵巢癌發(fā)生的致病因素和分子機(jī)制，可為卵巢癌的早期診斷和有效治療提供理論依據(jù)。

多種細(xì)胞因子參與了卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。本課題組的前期研究［3］表明，?；奈改c激素ghrelin可抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖。ghrelin主要由胃黏膜X/A樣細(xì)胞分泌，由28個氨基酸組成，在人體其他組織如下丘腦、垂體、海馬、大腦皮質(zhì)、小腸、胰腺及胎盤中，也都有少量的合成［4］。ghrelin存在獨特的翻譯后修飾，即第3位絲氨酸殘基在ghrelin?；傅淖饔孟掳l(fā)生酰基化 （主要為辛?；?-5］，形成?；痝hrelin （acyl ghrelin，AG） ，這種?；瘜hrelin結(jié)合并激活其受體——生長激素促泌素受體1a （growth hormone secretagogue receptor 1a，GHSR1a）十分關(guān)鍵［4］。AG可以通過作用于這種G蛋白耦聯(lián)受體，發(fā)揮刺激垂體生長激素釋放、刺激攝食、調(diào)節(jié)能量代謝等作用。因此長期以來，人們認(rèn)為AG是gh-relin的活性形式，而在血液中占較大比例 （90%） 的去酰基化ghrelin （des-acyl ghrelin，DAG） 并無生物學(xué)活性。然而越來越多的臨床證據(jù)表明，雖然不能激活GHSR1a，DAG仍然具有生物學(xué)功能。本研究通過觀察DAG對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響，旨在為分子生物靶向治療卵巢癌提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑

DAG （美國Phoenix Pharmaceuticals公司） ，亮氨酸 （美國Santa Cruz公司） ，Wnt通路激動劑SKL2001（美國Sigma公司） ，CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒 （日本同仁化學(xué)公司） ；Trizol、RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、螢光素酶報告基因檢測試劑盒 （美國Promega公司） ，Taq酶 （北京天根公司） ，Evergreen熒光染料 （美國Biotium公司） ，兔抗總核糖體蛋白S6和磷酸化S6（美國Cell Signaling Technology公司） ，Wnt信號通路活性檢測FOPF質(zhì)粒 （美國Millipore公司） ，jetPEI轉(zhuǎn)染試劑 （美國Polyplus-transfection公司） 。其他試劑均購于美國Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及CCK-8檢測細(xì)胞增殖

上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，達(dá)到對數(shù)生長期后接種于96孔板 （1×104/孔） 。12 h待貼壁后更換含不同濃度（10-10， 10-9， 10-8， 10-7mol/L） DAG的RPMI 1640培養(yǎng)液，以不含DAG的相同胎牛血清濃度的RPMI 1640完全培養(yǎng)液作為對照，或者加入亮氨酸、SKL2001處理48 h后收樣，每孔加入10 μ L CCK-8試劑，孵箱內(nèi)37℃放置1～4 h后，使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長的光吸收值［6-8］。

1.3 RNA提取

SKOV3細(xì)胞接種于6孔板，依上述處理后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入1 mL Trizol試劑晃動并吹打，待細(xì)胞全部裂解后移入EP管，室溫放置10 min；加入氯仿0.2 mL，劇烈顛倒混勻抽提15 s，室溫放置5 min，4 ℃下12 000 g離心15 min；上層水相轉(zhuǎn)移到新EP管中，加入等體積異丙醇充分混勻，置于-70 ℃沉淀2 h，4 ℃下12 000 g離心10 min；棄上清，用預(yù)冷的1 mL 75%乙醇洗滌沉淀后，4 ℃下12 000 g離心10 min；棄上清后瞬時離心，吸去殘液。晾干5～10 min后加20～50 μ L去RNA酶純水溶解并定量［6-8］。

1.4 實時定量PCR

使用Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為20 μ L反應(yīng)體系，2 μ g RNA起始量，依照試劑盒說明書進(jìn)行［6-8］。實時定量PCR為25 μ L反應(yīng)體系，以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物1 μ L為模板。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)后72 ℃延伸5 min［6-8］。采用Stratagene Mx3000軟件進(jìn)行分析。引物序列：人增殖細(xì)胞核抗原 （proliferating cell nuclear antigen，PCNA） 上 游5’-TGTTGGAGGCACTCAAGGA C-3’，下 游5’-TCATTGCCGGCGCATTTTAG-3’；人c-myc上游5’-TGCTCCATGAGGAGACACC-3’，下游5’-CTTTTCCACAGAAACAACATCG-3’；人cyclinD1上游5’-GAAGATCGTCGCCACCTG-3’，下游5’-GAC CTCCTCCTCGCACTTCT-3’；人β-actin上游5’-ATC TGGCACCACACCTTC-3’，下 游5’-AGCCAGGTCCA GACGCA-3’［6-8］。

1.5 熒光素酶活性測定

SKOV3細(xì)胞種植于12孔板中，以jetPEI試劑轉(zhuǎn)染0.5 μ g質(zhì)粒6 h后，給予DAG處理，孵育24 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌后勻漿，采用Promega公司的Dual-LuciferaseTMReporter Assay System 檢測熒光素酶活性［7，9］。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Prism軟件進(jìn)行分析和作圖。數(shù)據(jù)以x-±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls法。2組間比較采用組間t檢驗。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAG呈劑量依賴性抑制SKOV3細(xì)胞增殖

本研究首先探討了DAG對SKOV3細(xì)胞增殖的直接作用。CCK-8檢測結(jié)果顯示，10-10～10-7mol/L的DAG作用SKOV3細(xì)胞48 h可以顯著抑制細(xì)胞增殖（P ＜ 0.05，圖1B） ，且隨著胎牛血清濃度的增加，這種抑制作用仍然存在 （圖1A） 。實時定量PCR結(jié)果亦顯示，DAG組PCNA mRNA表達(dá)水平僅為對照組的50.4%，提示DAG組PCNA的表達(dá)顯著被抑制。

2.2 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 （mammalian target of rapamycin，mTOR） 信號途徑參與DAG對SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用

圖1 CCK-8檢測DAG對SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 DAG inhibition of SKOV3 cell proliferation as detected by the CCK-8 assay

本研究進(jìn)一步探討了DAG抑制SKOV3細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10-7nmol/L的DAG可顯著抑制SKOV3細(xì)胞中mTOR下游靶分子核糖體蛋白S6的磷酸化激活水平 （圖2） ，而以支鏈氨基酸亮氨酸激活mTOR信號途徑后，可以翻轉(zhuǎn)DAG對SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用 （圖3） 。

圖2 Western blotting檢測mTOR下游靶分子S6的磷酸化水平Fig.2 Phosphorylation level of the target molecule S6 downstream of mTOR as detected by Western blotting

圖3 CCK-8檢測mTOR激動劑亮氨酸翻轉(zhuǎn)DAG對SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.3 Inhibition of SKOV3 cell proliferation by the mTOR agonist，leucine-flipped DAG，as detected by the CCK-8 assay

2.3 DAG抑制SKOV3細(xì)胞經(jīng)典Wnt信號通路

FOPF質(zhì)粒是一種測定細(xì)胞內(nèi)β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性的方法，本研究以TOPFlash為報告質(zhì)粒、FOPFlash為陰性對照，以pRL-TK質(zhì)粒為內(nèi)參，SKOV3細(xì)胞jetPEI試劑轉(zhuǎn)染6 h后，10-7mol/L的DAG處理24 h后進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測，結(jié)果顯示DAG刺激下TOPFlash/FOPFlash比值明顯低于對照組 （P ＜ 0.05，圖4A） ，經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)通路下游靶基因c-myc與cyclinD1 mRNA水平明顯下調(diào) （P ＜0.05，圖4B） 。說明DAG可抑制經(jīng)典Wnt信號通路，使下游轉(zhuǎn)錄活性明顯降低。而以經(jīng)典Wnt通路激動劑SKL2001處理后，可以翻轉(zhuǎn)DAG對SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用 （圖5） 。

3 討論

本研究首次證實了DAG可通過mTOR信號途徑和經(jīng)典Wnt信號途徑抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖。依據(jù)如下： （1） DAG處理卵巢癌SKOV3細(xì)胞可抑制其增殖 （圖1） ； （2） DAG可抑制mTOR信號通路（圖2） 和經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)錄活性及下游靶基因mRNA水平 （圖4） ； （3） 激活mTOR （圖3） 和Wnt信號途徑（圖5） 可在一定程度上翻轉(zhuǎn)由DAG抑制的卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖。

DAG與AG具有相同的氨基酸序列，只是其第3位氨基酸 （絲氨酸3） 沒有辛?；?0］。起初，盡管DAG占據(jù)循環(huán)中總ghrelin的90%以上，但其長期以來被認(rèn)為是AG的一種降解產(chǎn)物，并且沒有生物學(xué)活性［11］。因其在生理學(xué)濃度范圍內(nèi)不能結(jié)合激活GHSR1a，所以在研究領(lǐng)域并未受到應(yīng)有的重視［4，12］。2004年，BROGLIO等［13］扭轉(zhuǎn)了普遍觀點，提出DAG也是一種激素。經(jīng)實驗證實，DAG可以拮抗AG某些生物學(xué)活性［14-15］，中樞或腹腔內(nèi)注射時，可以抑制AG的促食欲作用［16］；或者作為一種與AG完全無關(guān)的多肽而存在［17-18］。DAG與AG也可能存在相同的作用?？傮w來說，就外周作用而言，DAG在調(diào)節(jié)葡萄糖或胰島素代謝［19-21］、能量平衡［22］、胃腸蠕動［23］等方面存在與AG相反的作用，而在心血管方面的作用［12］則類似于AG。本研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌細(xì)胞增殖方面，DAG與AG起到協(xié)同作用，均可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

圖4 DAG抑制經(jīng)典Wnt信號通路Fig.4 DAG inhibits the classical Wnt signaling pathway

圖5 Wnt信號通路激動劑SKL2001翻轉(zhuǎn)DAG對SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.5 Inhibition of SKOV3 cell proliferation by the Wnt signaling pathway activator，SKL2001，and DAG turnover

mTOR可感受細(xì)胞內(nèi)外能量水平，通過調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯從而調(diào)節(jié)細(xì)胞和組織的存活、生長、增殖和分化［24］。mTOR的抑制劑雷帕霉素則可以抑制mTOR下游S6核糖體蛋白，抑制PCNA基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和分化。本研究闡明了DAG可以抑制mTOR及其下游靶分子S6的磷酸化激活，進(jìn)而抑制PCNA基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。

Wnt信號通路最初由小鼠乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典途徑激活過程中，胞質(zhì)β-catenin降解受抑制，異常蓄積，之后β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子或淋巴增強因子形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體，調(diào)控cyclinD1和c-myc等下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［25-26］，在腫瘤細(xì)胞的增殖和去分化過程中起著非常重要的作用。研究［27］表明，β-catenin在正常卵巢、良性卵巢腫瘤、交界性卵巢腫瘤及卵巢癌組織中的異常表達(dá)依次呈上升趨勢，這種異常分布與腫瘤的浸潤程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均相關(guān)；Wnt信號通路還可參與肝癌細(xì)胞的增殖［7］。本研究表明，DAG可抑制β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性；并且Wnt的下游靶基因cyclinD1和c-myc轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平亦明顯下降。本研究結(jié)果表明，DAG可能通過抑制Wnt信號通路，抑制了卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，DAG可通過抑制mTOR信號通路和經(jīng)典Wnt信號通路抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，從而為卵巢癌的治療提出新的思路。