張平，張浩，董文武，王志宏，秦元，董齊，2

（中國醫(yī)科大學(xué) 1. 附屬第一醫(yī)院甲狀腺外科，沈陽 110001；2. 人民醫(yī)院普通外科，沈陽 110016）

隨著甲狀腺手術(shù)方法的不斷改進(jìn)，其成功率和安全性越來越高，更多的甲狀腺疾病患者能獲得有效且滿意的治療［1］。但由于甲狀腺和甲狀旁腺解剖結(jié)構(gòu)的緊密性，甲狀腺手術(shù)勢必會對甲狀旁腺造成不同程度的損傷，從而導(dǎo)致術(shù)后甲狀旁腺功能減退癥 （簡稱甲旁減） ，這是影響甲狀腺手術(shù)安全性和術(shù)后療效的主要因素［2-3］。甲狀腺手術(shù)后的甲旁減發(fā)生率可高達(dá)14%［4］，即使是經(jīng)驗豐富的甲狀腺專科醫(yī)生施行手術(shù)后甲旁減發(fā)生率也可達(dá)0.5%～4%［5-6］。

目前甲旁減的治療多以藥物替代為主，但卻有服用繁瑣、不良反應(yīng)大、價格昂貴等缺點［7］。而甲狀旁腺的異體移植因免疫排斥、醫(yī)學(xué)倫理等諸多問題，臨床應(yīng)用受到限制。手術(shù)中甲狀旁腺的自體異位移植可取得良好的效果，但外科醫(yī)生在手術(shù)當(dāng)中并不能及時發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺的損傷或誤切。當(dāng)術(shù)后出現(xiàn)甲旁減時，已無可移植的種子細(xì)胞。因此，本研究擬探索建立應(yīng)用Sonic hedgehog （Shh） 和激活素A（Activin A） 將脂肪源性干細(xì)胞 （adipose-derived stem cells，ADSCs） 分化成甲狀旁腺樣細(xì)胞的方法，為治療甲旁減開辟一條嶄新的途徑。

1 材料與方法

1.1 脂肪細(xì)胞的獲取

選用清潔級、雄性、純系、4周齡SD大鼠，體質(zhì)量150～200 g。戊巴比妥鈉 （40 mg/kg） 腹腔注射麻醉后，無菌切取雙側(cè)腹股溝區(qū)脂肪，以備ADSCs的分離用。

1.2 ADSCs的分離、純化和鑒定

1.2.1 分離純化：將切取的脂肪組織置入含有1 000 U/mL青鏈霉素的PBS中浸泡10 min后，用不含抗生素的PBS反復(fù)沖洗，仔細(xì)去除血管和其他組織。將其剪成約1 mm×1 mm×1 mm的小塊，置于10 mL 0.075%Ⅰ型膠原酶中，37 ℃搖床120 r/min消化30 min。用等體積含10%胎牛血清的高糖DMEM中和膠原酶，1 200 r/min離心10 min。將沉淀物重懸后用200目篩網(wǎng)過濾，再次離心獲得細(xì)胞沉淀。使用紅細(xì)胞裂解液處理3 min，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM終止處理，PBS洗滌后接種于6 cm培養(yǎng)皿中，接種密度為2×105/cm2。48 h后更換培養(yǎng)基，去除未貼壁細(xì)胞。以后隔日半量換液。細(xì)胞90%融合后，0.25%胰酶消化，1∶3傳代接種。取第3代細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞鑒定。

1.2.2 誘導(dǎo)及鑒定：

1.2.2.1 細(xì)胞成脂誘導(dǎo)及鑒定 加入成脂誘導(dǎo)液 （含L-DMEM，10%胎牛血清，地塞米松1 μ mol/L，吲哚美辛200 μ mol/L，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤0.5 mmol/L，胰島素10 μ mol/L） 。隔日換液。誘導(dǎo)21 d后，油紅O染色，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴形成。

1.2.2.2 細(xì)胞成骨誘導(dǎo)及鑒定 加入成骨誘導(dǎo)液 （含L-DMEM，10%胎牛血清，地塞米松0.1 μ mol/L，抗壞血酸50 μ mol/L，β-甘油磷酸鈉10 mmol/L，維生素D3 0.01 μ mol/L） 。3 d換液1次。誘導(dǎo)21 d后，茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察鈣沉積。

1.3 建立ADSCs分化為甲狀旁腺樣細(xì)胞的方法

取第5代ADSCs，在含5% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，實驗組加入Shh （100 ng/mL） 和Activin A （75 ng/mL） ，對照組加入等量的溶劑DMSO，倒置顯微鏡下觀察分化細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實驗測定培養(yǎng)液中甲狀旁腺激素 （parathyroid hormone，PTH） 的含量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠ADSCs成脂誘導(dǎo)鑒定結(jié)果

ADSCs加入成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)21 d后，油紅O染色，倒置顯微鏡下觀察脂滴形成。結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量逐漸增加，證明ADSCs細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)成功。見圖1。

圖1 ADSCs成脂誘導(dǎo)后脂滴形成 ×400Fig.1 Lipid induced lipid droplets formation in ADSCs ×400

2.2 大鼠ADSCs成骨誘導(dǎo)鑒定結(jié)果

ADSCs加入成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)21 d后，茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察鈣沉積。結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)鈣鹽沉積的數(shù)量逐漸增加，證明ADSCs細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)成功。見圖2。

2.3 大鼠ADSCs向甲狀旁腺樣細(xì)胞分化誘導(dǎo)結(jié)果

將誘導(dǎo)成功的ADSCs在含Shh （100 ng/mL） 和Activin A （75 ng/mL） 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d后，酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測PTH含量。結(jié)果顯示，實驗組培養(yǎng)液中PTH含量［（97.27±11.26） pg/mL］大于對照組［（46.99±8.95） pg/mL］ ， 提 示Shh和Activin A對ADSCs分泌PTH有明顯的促進(jìn)作用 （P ＜ 0.05） ，見圖3；顯微鏡下觀察到大量甲狀旁腺樣細(xì)胞，見圖 4。

3 討論

圖3 Shh和Activin A處理ADSCs 21 d后PTH含量的變化Fig.3 Changes of PTH content after treatment of ADSCs for 21 d at different concentrations of Shh and Activin A

甲狀旁腺自體移植是減少甲旁減發(fā)生的重要措施。藥物替代是目前治療甲旁減的主要方式，包括人工合成的甲狀旁腺素、鈣劑、維生素D制劑等。這些藥物的應(yīng)用過程繁瑣，患者需要反復(fù)抽血監(jiān)測以調(diào)整用量，藥物本身還有很多不良反應(yīng)，導(dǎo)致患者的依從性較差［7］，嚴(yán)重影響藥物替代的臨床治療效果。而甲狀旁腺的異體移植，因免疫排斥、醫(yī)學(xué)倫理等諸多問題，臨床應(yīng)用也受到限制［10］。實踐證明，手術(shù)中甲狀旁腺的自體異位移植可取得良好的效果，有效率達(dá)70%～95%。甲狀旁腺適合細(xì)胞移植，究其原因有以下幾個方面［11-12］：（1） 甲狀旁腺無導(dǎo)管、濾泡及門脈循環(huán)，每個甲狀旁腺細(xì)胞都能獨(dú)立發(fā)揮和器官一樣的功能，無需器官構(gòu)建即可用于移植并發(fā)揮作用； （2） 移植少量的甲狀旁腺細(xì)胞，即可完成整個器官的正常功能； （3） 患者手術(shù)后發(fā)生的甲旁減多為醫(yī)源性的甲狀旁腺損傷，不存在免疫方面的異常，不影響移植效果。但由于術(shù)中情況的復(fù)雜性，外科醫(yī)生并不能及時發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺的損傷或誤切，當(dāng)術(shù)后出現(xiàn)甲旁減時，已無可移植的種子細(xì)胞。因此，找到充足、安全的甲狀旁腺種子細(xì)胞并進(jìn)行自體移植，成為臨床治愈甲旁減的唯一可能。

圖4 Shh和Activin A處理ADSCs 21d后細(xì)胞形態(tài)變化 ×200Fig.4 Morphological changes of cells after treatment of ADSCs for 21 d with Shh and Activin A ×200

干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展為解決這一問題提供了契機(jī)。干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。根據(jù)其來源可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞；根據(jù)其分化的細(xì)胞系，可分為造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等［13］。成體干細(xì)胞具有一定的可塑性，即來自某一組織的干細(xì)胞還可分化成其他組織類型的細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞是干細(xì)胞家族的重要成員，存在于人體的多種組織中，如骨髓、脂肪、胸腺、胰腺等成體組織，在體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為3個胚層的多種細(xì)胞和組織［14-15］。近來，國外已有學(xué)者在將干細(xì)胞分化為甲狀旁腺樣細(xì)胞的研究方面進(jìn)行了大膽嘗試。BINGHAM等［11］首次報告了在Activin A的作用下將胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞成功分化成甲狀旁腺樣細(xì)胞的經(jīng)驗。WOODS等［12，16］通過Activin A和Shh的誘導(dǎo)，分別從小兒的胸腺細(xì)胞和胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞中分化出甲狀旁腺樣細(xì)胞。GREEN等［17］應(yīng) 用Activin A、NOGGIN和SB-431542，將胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞和誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞分化成前腸管的內(nèi)胚層，并提出在Shh或FGF8的作用下可能進(jìn)一步分化出甲狀旁腺樣細(xì)胞。目前國內(nèi)在該領(lǐng)域的研究尚屬空白。2001年和2002年ZUK等首先描述了ADSCs的多向潛能。ADSCs屬于成體間充質(zhì)干細(xì)胞的一種，具有相似的分化特性。它具有來源豐富、取材簡便安全、所含的干細(xì)胞數(shù)量多、具有一定的抗感染能力等諸多優(yōu)點［8-9］，臨床應(yīng)用前景十分廣闊。目前其分離、培養(yǎng)、純化、鑒定技術(shù)均已成熟［9，18-19］。它具有多向分化潛能，可成功分化為3個胚層的多種細(xì)胞和組織［20-21］，部分已應(yīng)用于臨床。大量研究表明，Activin A和Shh在干細(xì)胞分化成甲狀旁腺樣細(xì)胞的過程中起著至關(guān)重要的作用。

本研究從大鼠脂肪細(xì)胞分離出ADSCs，應(yīng)用100 ng/mL Shh+75 ng/mL Activin A誘導(dǎo)21 d，培養(yǎng)基中PTH明顯增加，證明ADSCs成功分化成甲狀旁腺樣細(xì)胞，為脂肪源性干細(xì)胞分化成甲狀旁腺樣細(xì)胞提供了理論和實踐的基礎(chǔ)，為下一步進(jìn)行甲狀旁腺樣細(xì)胞的自體移植提供了新的來源，同時也為治愈甲旁減開辟了一條嶄新的途徑。