王冰，黃寶俊，解大龍，趙丹懿

（1. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤一科，遼寧 大連 116027； 2. 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，沈陽 110004；3. 中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，沈陽 110122）

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是最常見的惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率居各類腫瘤之首，且發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢［1-2］。胃癌的治療策略是手術(shù)結(jié)合放化療的綜合治療，化療能夠顯著改善胃癌的預(yù)后，降低胃癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。但化療耐藥降低了胃癌對化療藥物的敏感性，限制了化療的臨床應(yīng)用［3］。因此，深入研究胃癌化療耐藥發(fā)生的分子機制，尋找新的治療靶點是胃癌研究的方向和重點。

長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA） 是近年來生命科學(xué)特別是腫瘤學(xué)研究的熱點，因其缺少或沒有開放閱讀框而無蛋白編碼功能，通常以RNA形式通過表觀遺傳調(diào)控或轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方式調(diào)控功能基因的表達(dá)水平［4-5］。目前，腫瘤中差異表達(dá)lncRNA已經(jīng)為腫瘤的預(yù)后判斷和治療提供了新的方向［6-7］。近期研究［8-11］發(fā)現(xiàn)，漿細(xì)胞瘤可變易位1（lncRNA-plasmacytoma variant translocation 1，lncRNA-PVT1）基因在包括胃癌的多種腫瘤中均存在表達(dá)和功能的異常，并作為潛在的癌基因發(fā)揮作用。本研究擬探討PVT1基因?qū)ξ赴┘?xì)胞化療敏感性的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：胃癌阿霉素耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR由本課題組構(gòu)建并保存［12-13］。

1.1.2 主要試劑：胎牛血清及DMEM 高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)公司；擴增引物由上海生工生物工程公司合成；RNA提取試劑TRN-zol及l(fā)nRcute lncRNA熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化科技公司；PVT1抑制物SmartSilencer-PVT1（ss-PVT1） 及其對照ss-NC由廣州銳博生物科技公司合成；轉(zhuǎn)染試劑HiPerFect購自德國QIAGEN公司；阿霉素和碘化丙啶 （propidium iodide，PI） 為美國Sigma-aldrich公司產(chǎn)品；增強型CCK8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 實時定量PCR：應(yīng)用TRNzol 試劑按照說明書指導(dǎo)提取待測細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以β-actin為內(nèi)參基因，應(yīng)用lnRcute lncRNA熒光定量檢測試劑盒擴增PVT1基因。PVT1的上游引物為5’-BUCCCCTTCTATGGGAATCACTA -3’，下游引物為5’- GGGBUCAGAGATGAAATCGTAAT -3’； β-actin的上游引物為5’- GCACCACACCTTCTACAATGAG-3’，下游引物為5’- ACAGCCTGGATGGCTACGT -3’。反應(yīng)體系為：2倍濃度lnR預(yù)混液 12.5 μ L，50倍濃度ROX 參比染料 0.5 μ L，上游/下游引物 （10 μ mol/L）各0.625 μ L，cDNA模板1 μ L，加無核酸酶水至25 μ L。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，然后按95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s進(jìn)行40個循環(huán)。應(yīng)用比較CT值法對PVT1的表達(dá)量進(jìn)行相對定量分析。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：在轉(zhuǎn)染之前，將5×104個待測細(xì)胞接種在6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。應(yīng)用HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑按照說明書指導(dǎo)，將ss-PVT1及ss-NC分別轉(zhuǎn)染待測細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)5～6 h，更換培養(yǎng)基后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48 h。轉(zhuǎn)染ss-NC的細(xì)胞為陰性對照組，轉(zhuǎn)染ss-TUG1的細(xì)胞為PVT1沉默組。

1.2.3 增強型CCK8法檢測細(xì)胞增殖活力：將待測細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化后，離心并重懸于無血清培養(yǎng)基中（密度為1×105/mL） 。將100 μ L細(xì)胞懸液接種于96 孔板中，然后加入10 μ L CCK-8 試劑，37 ℃孵育2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀處測定吸光度值 （450 nm） 。

1.2.4 單標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期：待測細(xì)胞經(jīng)胰酶消化處理為單個細(xì)胞，冰乙醇固定，RNaseA （終濃度為0.1 g/L） 消化30 min；然后用250 μ L PI （0.05 g/L） 室溫避光染色30 min；流式細(xì)胞儀 （FACScan，BectonDickison） 檢測，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為635 nm；CELLQuest3.0軟件分析細(xì)胞周期。

1.2.5 雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：待測細(xì)胞經(jīng)不含EDTA的胰酶消化、離心；PBS清洗，離心后棄掉上清，加入500 μ L結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞；加入5 μ L Annexin V-FITC，輕輕混勻；再加入5 μ L PI，輕輕混勻。室溫避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率，位于右下象限的FITC-Annexin V陽性/PI陰性的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。

1.2.6 藥物敏感性檢測：將待測細(xì)胞接種于96 孔板，常規(guī)培養(yǎng)12 h。然后，應(yīng)用不同濃度（ 0.1 μ g/mL、0.5 μ g/mL、1 μ g/mL、5 μ g/mL、10 μ g/mL和50 μ g/mL）的阿霉素處理待測細(xì)胞［12-13］。48 h后應(yīng)用增強型CCK8法檢測各組細(xì)胞的OD值。采用Probit 回歸模型計算半數(shù)抑制濃度（ half maximal inhibitory concentration，IC50） 。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。每組實驗重復(fù)5次，計量資料以x-±s表示。陰性對照組與PVT1沉默組中PVT1的表達(dá)以及細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的比較分析采用 t 檢驗。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PVT1沉默提高SGC7901/ADR細(xì)胞對阿霉素的敏感性

將ss-PVT1轉(zhuǎn)染SGC7901/ADR細(xì)胞后，應(yīng)用實時定量PCR檢測PVT1基因的沉默效果，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染ss-PVT1能夠顯著降低SGC7901/ADR細(xì)胞中PVT1基因的表達(dá) （圖1A，P ＜ 0.05） 。

然后，檢測PVT1基因沉默的SGC7901/ADR細(xì)胞對阿霉素的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， PVT1沉默的SGC7901/ADR細(xì)胞中阿霉素的半數(shù)抑制濃度為（2.25±0.42） μ g/mL，而在轉(zhuǎn)染ss-NC的SGC7901/ADR細(xì)胞中，阿霉素的IC50為 （5.68±0.57） μ g/mL （圖1B，P ＜ 0.05） 。PVT1沉 默 顯 著 抑 制 了 阿 霉 素 在SGC7901/ADR細(xì)胞中IC50，增強了SGC7901/ADR細(xì)胞對阿霉素的化療敏感性。

2.2 PVT1沉默顯著增強了阿霉素對SGC7901/ADR細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)

圖1 PVT1沉默提高SGC7901/ADR細(xì)胞對阿霉素的敏感性Fig.1 Silencing of PVT1 enhances the chemosensitivity of SGC7901/ADR cells to adriamycin

應(yīng)用0.5 μ g/mL的阿霉素處理SGC7901/ADR細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染ss-NC的SGC7901/ADR細(xì)胞相比，PVT1沉默的SGC7901/ADR細(xì)胞的增殖活力顯著降低 （圖2A，P ＜ 0.05） ，細(xì)胞阻滯于G1期 （圖2B，P＜0.05） ，而且細(xì)胞凋亡率明顯增加 （圖2C，P ＜0.05） 。

圖2 PVT1沉默顯著增強了阿霉素對SGC7901/ADR細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)Fig.2 Silencing of PVT1 enhances adriamycin-induced cytotoxicity to SGC7901/ADR cells

3 討論

近年來的研究顯示，非編碼RNA特別是lncRNA與腫瘤化療耐藥的發(fā)生密切相關(guān)，多種lncRNA的異常表達(dá)和功能促進(jìn)了化療耐藥的發(fā)生和進(jìn)展，某些lncRNA能夠作為惡性腫瘤特別是胃癌化療效果不佳以及預(yù)后不良的分子標(biāo)志物。例如，F(xiàn)ANG等［14］報道尿路上皮癌相關(guān)1 （urothelial carcinoma associated 1，UCA1） 基因能夠通過下調(diào)miR-27b促進(jìn)胃癌細(xì)胞對化療藥物阿霉素、順鉑和5-氟尿嘧啶的耐藥性；前期研究［12］發(fā)現(xiàn)，核富集豐富轉(zhuǎn)錄物1 （nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1） 基因高表達(dá)與胃癌患者對阿霉素的低反應(yīng)密切相關(guān)，敲除NEAT1能夠抑制胃癌對阿霉素的耐藥性。

PVT1與腫瘤化療相關(guān)的研究較少，近期的研究［15-17］發(fā)現(xiàn)，PVT1與結(jié)直腸癌、卵巢癌和胰腺癌的化療耐藥相關(guān)。而且ZHANG等［18-19］研究發(fā)現(xiàn)，PVT1在順鉑耐藥的胃癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，PVT1的高表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌對順鉑的耐藥。但PVT1是否參與惡性腫瘤特別是胃癌對阿霉素的耐藥尚無報道。

在前期的研究工作中，建立了阿霉素耐藥的SGC7901/ADR細(xì)胞，其顯示出了對阿霉素明顯的耐藥性，耐藥指數(shù)為4.28［13］。阿霉素屬于抗腫瘤抗生素，抗瘤譜較為廣泛，對包括胃癌的多種腫瘤均有較強的治療作用。阿霉素主要通過嵌入DNA進(jìn)而抑制核酸的合成，具有較強的細(xì)胞毒性作用，對各種生長周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)可以靶向沉默SGC7901/ADR細(xì)胞中PVT1的表達(dá)。藥物敏感性實驗發(fā)現(xiàn)，PVT1沉默能夠顯著降低阿霉素在SGC7901/ADR細(xì)胞中IC50，提高SGC7901/ADR細(xì)胞對阿霉素的化療敏感性。同時，在0.5 μ g/mL的阿霉素的作用下，PVT1沉默能夠抑制SGC7901/ADR細(xì)胞的增殖活力，阻滯細(xì)胞于G1期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。PVT1沉默能夠提高SGC7901/ADR細(xì)胞對阿霉素的化療敏感性，并提高阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。但PVT1基因在胃癌化療耐藥中分子機制尚不清楚，還需要進(jìn)一步的深入研究。ZHANG等［19］報道PVT1能夠逆轉(zhuǎn)康萊特膠囊對多藥耐藥蛋白1 （multidrug resistance protein 1，MDR1） 基因的抑制作用。MDR1基因編碼P糖蛋白，其位于細(xì)胞膜上，具有藥物泵作用，能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞的藥物泵出細(xì)胞外進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥。因此，可以推測PVT1可能通過上調(diào)MDR1的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞對阿霉素的耐藥。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)lncRNA-PVT1與胃癌的化療耐藥相關(guān)，PVT1沉默能夠提高胃癌耐藥細(xì)胞對阿霉素的化療敏感性。這有助于明確胃癌化療耐藥的發(fā)生機制，為胃癌的分子治療提供新的靶點。