姜曉曉，周祖華，常棟，齊中華

（1. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心臟外科，遼寧 大連 116011； 2. 遼寧省軍區(qū)大連第十六離職干部休養(yǎng)所門診部，遼寧 大連 116041；3. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 大連 116011；4. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連 116011）

研究［1］顯示，急性心肌梗死患者中心源性猝死占50%。研究［2］發(fā)現(xiàn)心肌梗死后心臟神經(jīng)重塑，梗死區(qū)神經(jīng)纖維壞死，局部去神經(jīng)，隨后出現(xiàn)交感神經(jīng)芽生，造成非梗死區(qū)交感神經(jīng)密度增加，從而增加了心臟對室性心律失常和心源性猝死的易感性。神經(jīng)生長因子 （nerve growth factor，NGF） 是神經(jīng)營養(yǎng)因子，對交感神經(jīng)的損傷修復(fù)具有重要作用［3］。研究［4］發(fā)現(xiàn)心肌梗死3.5 h后心肌組織中的神經(jīng)生長因子明顯增加，隨后引起交感神經(jīng)芽生。心肌梗死后，白細胞介素1 β （interleukin-1 β，IL-1 β） 促進炎癥反應(yīng)卻延遲肌成纖維細胞活化。向心肌缺血的犬左星狀神經(jīng)節(jié)內(nèi)注射IL-1 β，可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)重塑增加室性心律失常的發(fā)生［5］。白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，存在于多種植物 （花生、虎杖、葡萄等） 。研究［6］表明白藜蘆醇具有抗腫瘤、治療心血管疾病、抗氧化、誘導(dǎo)細胞凋亡等生物學(xué)活性。本研究探討白藜蘆醇對心肌梗死大鼠心臟神經(jīng)重塑的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

8周左右、雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量200 g，由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實驗中心提供。實驗得到大連醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。白藜蘆醇購于美國 sigma 公司。

1.2 心肌梗死模型建立及分組

大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛 （300 mg/kg） 麻醉，切開氣管進行插管，利用小動物呼吸機為大鼠輔助通氣 （呼吸頻率設(shè)定為65次/min，呼吸潮氣量設(shè)定為2.5 mL） 。沿左胸第5肋間剪開心包后，手術(shù)線結(jié)扎前降支近心端2 mm處冠狀動脈建立心肌梗死模型［7］。Sprague-Dawley大鼠隨機均分為3組：假手術(shù)組 （n = 10，縫線穿過冠狀動脈前降支下方但不結(jié)扎） 、手術(shù)組 （n = 10，結(jié)扎冠狀動脈前降支） ，手術(shù)給藥組［n = 10，結(jié)扎冠狀動脈前降支同時前降支注射白藜蘆醇 （40 mg/kg） ］。

1.3 電生理刺激檢測

大鼠手術(shù)4周后進行電生理刺激檢測。麻醉開胸后將電極放在右心室心外膜，給予體外電刺激（電刺激儀，四川科儀誠科技有限公司，QL/N-IV ） 。刺激程序：共11次刺激，包括起搏刺激 （8次，時間間隔160 ms） 和額外刺激 （3次，第1次和第2次時間間隔為100 ms，第2次和第3次時間間隔50 ms） 。心律失常判斷標(biāo)準(zhǔn)［7］：心律失常＜6次，正常； 6次≤心律失常＜15次，非持續(xù)性室性心律失常；心律失常≥15次，持續(xù)性室性心律失常。

1.4 Western blotting檢測

在冰盒上取手術(shù)組、手術(shù)給藥組大鼠心肌梗死周邊心肌組織（200 mg），假手術(shù)組大鼠心肌組織選取與心肌梗死組大鼠相同區(qū)域，用1 mL組織裂解液裂解組織。勻漿后放入1.5 mL EP管中1 3000 r/min，4 ℃，15 min離心，取上清用于后續(xù)蛋白實驗。用BCA法測蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)整為3 μ g/μ L，配置12%濃度分離膠10 mL，5%濃度積層膠4 mL，上樣量為20 μ L，電泳設(shè)置電壓80 V，30 min，然后電壓120 V，60 min，電壓100 V濕轉(zhuǎn)蛋白到PVDF膜上60 min，用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜室溫1 h，加入一抗NGF（ 1∶1 000） 、IL-1b（ 1∶1 000） 、GAPDH（ 1∶4 000） ，排除氣泡，封口后4 ℃過夜。TBST洗膜3次，5 min/次。加入稀釋后到二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，5 min/次。增強發(fā)光液顯影。使用Image J軟件進行蛋白的灰度分析，目的蛋白采用目的蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值表示。實驗重復(fù)3次。

1.5 實時 PCR檢測

手術(shù)后4周，剪取心肌梗死附近組織（假手術(shù)組大鼠心肌組織選取與心肌梗死組大鼠相同區(qū)域 ，約200 mg），使用1 mL Trizol裂解，勻漿器進行勻漿，Vertex震蕩30 s，加入0.2 mL 氯仿，震蕩30 s后 室 溫 放 置3～5 min， 12 000 r/min， 4 ℃離心15 min，吸取上層水相放入EP管，加等體積異丙醇，混勻后室溫放置30 min；然后12 000 r/min，4 ℃離心10 min后棄掉上清，加入75%乙醇（ 1 mL） ，7 500 r/min，4 ℃離心10 min后棄掉上清，室溫干燥10 min，溶于DEPC水用于后續(xù)實驗。NGF引物序列：上 游 5’-TCCACCCACCCAGTCTTCCA-3’，下游5’-GCCTTCCTGCTGAGCACACA-3’；IL-1b引 物 序列：上 游 5’-GGGATGATGACGACCTGC-3’，下 游5’-CCACTTGTTGGCTTATGTT-3’； GAPDH引 物 序列：上 游 5’-CTTCACCACCATGGAGAAGGC-3’，下游5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。相對表達量參照內(nèi)參基因GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化，所有反應(yīng)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用 2-ΔΔCt方法計算。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用x-±s表示，組間比較采用單因素方差分析 （One-Way ANOVA） 。心律失常評分是非正態(tài)分布，采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠心律失常誘導(dǎo)結(jié)果

大鼠手術(shù)4周后心律失常檢測結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠未發(fā)生室性心律失常。手術(shù)組中8只 （80%）發(fā)生室性心律失常，手術(shù)給藥組5只 （50%）發(fā)生室性心律失常；2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。

2.2 3組大鼠心肌組織中NGF、IL-1 β mRNA及蛋白表達

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，手術(shù)組、手術(shù)給藥組心肌組織NGF、IL-1 β mRNA及蛋白表達均升高 （P ＜ 0.05） 。與手術(shù)組比較，手術(shù)給藥組心肌組織NGF、IL-1 β mRNA表達均降低 （P ＜ 0.05） 。見表1，圖1、2。

表1 3組大鼠心肌組織中NGF、IL-1 β mRNA及蛋白表達比較Tab.1 Myocardial expression of NGF，IL-1 β mRNA and protein in 3 rat groups

圖1 大鼠心肌梗死周邊區(qū)心肌NGF、IL-1b蛋白表達Fig.1 Myocardial expression of NGF and IL-1b protein in 3 rat groups

圖2 大鼠心肌梗死周邊區(qū)心肌NGF、IL-1 β mRNA表達Fig.2 Myocardial expression of NGF and IL-1 β mRNA in 3 rat groups

3 討論

關(guān)于心肌梗死后大鼠神經(jīng)重構(gòu)的影響與作用機制，李軍等［8］研究發(fā)現(xiàn)Ghrelin干預(yù)能夠抑制大鼠心肌梗死后的神經(jīng)增生，IL-1 β參與其中。小腦頂核刺激可以改善心肌梗死后大鼠心臟神經(jīng)功能［9］。局灶性遠端前壁心肌梗死改變了交感神經(jīng)的局部和全局模式，導(dǎo)致梗死心臟激活恢復(fù)間期縮短，復(fù)極離散度增加。這些條件可能是在交感神經(jīng)增強時引發(fā)心律失常機制的基礎(chǔ)［10］。星狀神經(jīng)節(jié)水平對心肌損傷所致的有害神經(jīng)重塑以及隨后的交感神經(jīng)活性增加可能是交感神經(jīng)致心律失常的關(guān)鍵因素［11］。

本研究結(jié)果顯示，大鼠心肌梗死周邊心肌組織中NGF mRNA和蛋白的表達水平升高，NGF表達增高能夠引起心臟交感神經(jīng)過度再生。白藜蘆醇能夠降低梗死后心肌組織中NGF mRNA和蛋白表達水平。白藜蘆醇能在小鼠急性心肌梗死后，通過SIRT1正?；?p53失活通路增強心肌基質(zhì)細胞衍生因子的分泌，從而保護心臟［12］。本研究也發(fā)現(xiàn)大鼠心梗周邊區(qū)心肌組織中的IL-1 β表達明顯增加。手術(shù)給藥組IL-1 β表達水平明顯低于手術(shù)組 （P ＜ 0.05） 。研究［13］表明心肌梗死后IL-1 β表達迅速升高，與本研究結(jié)果一致。IL-1 β表達增加促進心肌梗死后心肌重塑，還能促進心肌中非神經(jīng)細胞合成NGF［14］。白藜蘆醇能夠降低IL-1 β的表達，并間接減少NGF的生成，從而抑制心肌梗死后的心臟交感神經(jīng)過度再生。

綜上所述，白藜蘆醇可減少心肌梗死大鼠心肌組織中NGF、IL-1 β蛋白和mRNA的表達，進而抑制心臟神經(jīng)重塑，預(yù)防室性心律失常和心源性猝死。本研究不足之處是僅在分子水平上進行了驗證，電生理方面證據(jù)缺乏，需進一步深入研究。