孫溢華，邢佳鑫，宣金鋒，姚軍，夏皙，王保捷

（1. 中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)物證學(xué)教研室，沈陽 110122； 2. 蘇州市公安局吳中分局，江蘇 蘇州 215104）

目前短串聯(lián)重復(fù)序列 （short tandem repeats，STR） 是應(yīng)用于法醫(yī)DNA分型的主要遺傳標(biāo)記［1］，其中常染色體STR遺傳標(biāo)記和Y染色體STR遺傳標(biāo)記應(yīng)用較為成熟，廣泛用于個體識別與親緣關(guān)系鑒定中，已經(jīng)有多種商品化試劑盒。而X染色體STR（X-STR） 遺傳標(biāo)記在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究與應(yīng)用相對滯后［2］。

X-STR遺傳標(biāo)記具有獨(dú)特的遺傳方式，在某些特殊的親緣關(guān)系鑒定中可發(fā)揮獨(dú)特的應(yīng)用價值［3-5］。人類女性有2條X染色體，而男性只有1條，X染色體遺傳標(biāo)記的遺傳特征既不同于常染色體，也不同于Y染色體，母親的2條X染色體上的等位基因可隨機(jī)傳遞給子女；父親則只能將其X染色體的基因傳遞給女兒，其傳遞的X染色體必定來源于女兒的祖母［6］。

在某些特殊的親緣關(guān)系 （父女關(guān)系、母女或母子關(guān)系、祖母與孫女關(guān)系、同父的姐妹關(guān)系等） 鑒定時，當(dāng)檢測結(jié)果≥50%的X-STR型別一致時，結(jié)論是不能否定也不能肯定具有上述親緣關(guān)系。超過50%的X-STR型別一致時，可能是源于親緣的遺傳，也可能是隨機(jī)的一致，如能證明是親緣的遺傳，則增加了親緣關(guān)系指數(shù)；如能證明是隨機(jī)的一致，則排除了親緣關(guān)系［7］。X-STR側(cè)翼序列單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的型別可能在證明是親緣遺傳或是隨機(jī)一致的較好指標(biāo)。

2人混合樣品的個人識別鑒定一直是法醫(yī)物證檢驗的難題［8］。對混合樣品STR檢測譜型的分析在不能排除嫌疑人時也很難確定是嫌疑人。最好的辦法是在混合樣品中能夠分別檢測不同嫌疑人的遺傳標(biāo)記型別［9］。嫌疑人如STR側(cè)翼序列的SNP型別不同，通過序列特異性引物擴(kuò)增的方法可能實現(xiàn)分別檢測不同嫌疑人的STR型別，從而達(dá)到個人識別目的。

本研究擬以X染色體DXS7423基因座側(cè)翼序列SNPs （rs762822、rs546652、rs762822和rs546652） 為指標(biāo)，探討其用于某些特殊親緣關(guān)系及2人混合樣品的個人識別鑒定的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1組三代四口家系 （祖母、父親、母親、孫女） 和1組三代五口家系 （祖母、父親、母親、兩個異卵雙生孫女） 血液樣本；2個DXS7423基因座及側(cè)翼序列rs17279108分型不同的男性個體血液樣本。所有樣品提供者均已簽署知情同意書。蛋白酶K （德國Merck公司） 、Chelex 100 （美國Bio-Rad公司） 、瓊脂糖（西班牙Biowest公司） 、Investigator Argus X-12 試劑盒（德國Qiagen公司） 。NanoDrop 2000超微量分光光度計、ABI-9700型PCR擴(kuò)增儀和ABI-3500遺傳分析儀均購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及定量：采用 chelex-100 法提取DNA［10］，經(jīng)NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測后稀釋至適合濃度。

1.2.2 SNP位點(diǎn)的篩選及引物設(shè)計：選取DXS7423基因 座 附近 的rs762822、 rs546652、 rs17279108和rs529211 4個頻率較好的SNPs位點(diǎn)。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，并由寶生物工程 （大連） 有限公司合成。見表1、圖1。

表1 引物序列及產(chǎn)物長度Tab.1 Primer sequences and PCR product lengths

圖1 含DXS7423基因座上下游的擴(kuò)增片段及SNPs位置示意圖Fig.1 Locations of the DXS7423 locus，primers，and SNPs

1.2.3 PCR擴(kuò)增：上游片段PCR擴(kuò)增體系20 μ L，含rTaqDNA聚合酶（ 5 U） 2 μ L；10×PCR Buffer（ 含Mg2+）2 μ L；dNTP 2 μ L；引物各1.5 μ L；滅菌去離子水9 μ L；DNA模板 2 μ L。94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。下游片段PCR擴(kuò)增體系20 μ L，含LA TaqDNA聚合酶（ 5 U） 2 μ L；10×LA PCR Buffer（ 含Mg2+） 2 μ L；dNTP 2 μ L；引物各1.5 μ L；滅菌去離子水 9 μ L；DNA模板 2 μ L。94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，68 ℃ 1 min，72 ℃ 20 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。Investigator Argus X-12 試劑盒的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照使用手冊。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：DXS7423基因座上下游擴(kuò)增產(chǎn)物委托寶生物工程（ 大連） 有限公司進(jìn)行測序。Investigator Argus X-12 試劑盒的復(fù)合擴(kuò)增產(chǎn)物使用ABI-3500遺傳分析儀進(jìn)行檢測。

1.2.5 序列特異性引物（ sequence specific primer，SSP） PCR：根據(jù)rs17279108（ A/T） SNP位點(diǎn)分別設(shè)計序列特異性引物，并設(shè)計1條公共引物。公共引物為5’-TCTCCTGACACTGAGAGATCATAGC-3’；序列特異性引物（ A） 為 5’-CTCCAGAATGCGAGCCCTCT-3’，產(chǎn)物長度286 bp；序列特異性引物（ T） 為5’-CCAGA ATGCGAGCCCTCA-3’，產(chǎn)物長度284 bp。選取2個男性樣品，二者的rs17279108位點(diǎn)和DXS7423位點(diǎn)分型結(jié)果分別為A/15和T/14，及二者DNA不同比例的混合液（ 前者為高組分，后者為低組分） 。

Taq HS Perfect Mix 2×10 μ L；公共引物3 μ L；序列特異性引物（ A或T） 3 μ L；滅菌去離子水1.3 μ L；DMSO1.7 μ L；DNA模板1 μ L。94 ℃ 3 min；94 ℃ 5 s，64 ℃ 1 s，68 ℃ 10 s，30個循環(huán)；68 ℃ 10 min。

1.2.6 不同比例混合樣品的檢測：將2例男性樣品DNA按照1∶5、1∶10、1∶20、1∶50和1∶100進(jìn)行混合。用Investigator Argus X-12試劑盒對混合樣品進(jìn)行擴(kuò)增，不同比例混合的樣品進(jìn)行擴(kuò)增時，所加入擴(kuò)增體系中的DNA模板總量均為10 ng，并采用毛細(xì)管電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測分型。應(yīng)用PCR-SSP方法對混合樣品進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠檢測。

2 結(jié)果

2.1 家系樣品檢測結(jié)果

通過對2個家系的檢測，獲得了9個樣品的分型結(jié)果，見表2。

2.2 PCR-SSP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

PCR-SSP擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，見圖2。

表2 2個家系4個SNPs位點(diǎn)及DXS7423基因座的分型結(jié)果Tab.2 The genotypes in two families

2.3 PCR-SSP擴(kuò)增產(chǎn)物的DXS7423位點(diǎn)測序分型結(jié)果

測序結(jié)果如表3所示。根據(jù)樣品的測序結(jié)果，參考國際法醫(yī)遺傳學(xué)會 （international society of forensic genetics，ISFG） 命名規(guī)范［11］，將2個樣品分別命名為“15”和“14”，這與該樣品經(jīng)Investigator Argus X-12試劑盒檢測分型結(jié)果相一致。

2.4 不同比例混合樣品檢測結(jié)果

采用Investigator Argus X-12試劑盒對不同混合比例的樣品進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，在1∶20時，低組分隱約可見；在1∶50的時候低組分在圖譜中已無法顯示。在采用PCR-SSP方法對不同混合比例的樣品進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，在1∶50，甚至1∶100的比例時，低組分樣品對應(yīng)的擴(kuò)增體系依然有擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，見圖3。

圖2 PCR-SSP擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR-SSP products

表3 PCR-SSP擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果及等位基因命名Tab.3 Sequencing data and alleles of two male samples

圖3 不同混合比例樣品毛細(xì)管電泳圖譜Fig.3 DXS7423 genotype of mixed samples in different proportions

3 討論

在遺傳過程中，父親全部X染色體都傳遞給女兒；母親隨機(jī)將其中的1條X染色體傳遞給女兒或兒子；祖母隨機(jī)將1條X染色體傳遞給了兒子，兒子又將其全部傳遞給了孫女；同父的姐妹將具有來自父親的相同的X染色體，X-STR側(cè)翼序列SNPs不受染色體交叉的影響［12］。

當(dāng)2個個體在某一基因座表現(xiàn)出相同的等位基因，那么這種一致性產(chǎn)生的原因可能是偶然或者遺傳導(dǎo)致的。如果該基因座側(cè)翼序列的SNPs表現(xiàn)出不一致的分型結(jié)果，則說明該相同等位基因的出現(xiàn)是隨機(jī)的，在進(jìn)行親緣關(guān)系計算時應(yīng)排除掉該位點(diǎn)。如果側(cè)翼序列的SNPs分型結(jié)果一致，則支持了相同等位基因是由遺傳獲得的這種可能性。如果采用高通量測序等新一代的測序技術(shù)，可以同時檢測多個X-STR側(cè)翼序列內(nèi)的大量SNPs位點(diǎn)［13-14］，測序結(jié)果有助于特殊親緣關(guān)系推斷。DXS7423基因座側(cè)翼序列的4個SNPs有超過50%的可能區(qū)分2個無關(guān)個體。如果將檢測的側(cè)翼序列的范圍擴(kuò)大，會有新SNPs位點(diǎn)被檢出，可進(jìn)一步提高二者區(qū)分概率。

本研究應(yīng)用PCR-SSP方法，制備已知X-STR型別的2個個體混合樣品。在檢測樣品DXS7423基因座側(cè)翼序列SNPs的基礎(chǔ)上，根據(jù)SNPs型別差異，設(shè)計序列特異性引物對含有DXS7423基因座的片段分別進(jìn)行擴(kuò)增，對擴(kuò)增片段進(jìn)行X-STR基因座分型檢測，分別成功地獲得了2個個體的DXS7423基因座型別。根據(jù)本實驗結(jié)果，如果能夠篩選足夠多的側(cè)翼序列的SNPs有差別的X-STR基因座位進(jìn)行檢測，可能解決2個混合斑的個人識別問題。

在篩選SNPs的過程中，應(yīng)注意SNPs位置，選用的SNPs所在位置應(yīng)在X-STR商品化試劑盒中的引物結(jié)合區(qū)外側(cè)，以避免在進(jìn)行X-STR分型時可能出現(xiàn)基因座丟失的問題；由于不同案件中的嫌疑人差別，不可能使用固定的復(fù)合擴(kuò)增體系進(jìn)行不同案件的檢測，因此需要根據(jù)具體案情采用不同的條件構(gòu)建復(fù)合擴(kuò)增體系；應(yīng)用新一代測序技術(shù)，可同時對較多STR側(cè)翼序列的SNPs進(jìn)行檢測，可達(dá)到篩選足夠的待測STR基因座目的。但要注意此方法中的錯誤率，必要時可以多次檢測或者輔以其他方法進(jìn)行檢測，從而完成SNPs篩選。