劉巖 李慧 趙丹丹 程穎

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種發(fā)病率高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類健康，根據(jù)中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，結(jié)直腸癌已成為我國發(fā)病率及病死率均居第5位的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐步上升趨勢［1-2］。

近年來，分子靶向治療在某些特定人群中療效顯著，基于生物標(biāo)志物指導(dǎo)下的靶向藥物延長了患者生存并改善了生活質(zhì)量，細胞程序性死亡配 體 1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）和錯配修復(fù)（mismatch repair def i cient，MMR）基因已經(jīng)成為免疫靶向藥物最重要的生物標(biāo)志物，Pembrolizumab二線治療的推薦人群為PD-L1表達≥1%，一線治療優(yōu)勢患者的PD-L1需≥50%［3-4］，同時也被獲批治療帶有MMR缺失（def i cient mismatch repair，dMMR）的實體瘤患者。

腫瘤異質(zhì)性是導(dǎo)致腫瘤耐藥和治療療效差異的重要原因之一，腫瘤異質(zhì)性包括腫瘤間異質(zhì)性和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。為了探討MMR和PD-L1在同一腫瘤標(biāo)本中的異質(zhì)性，本研究分析結(jié)直腸癌患者腫瘤組織標(biāo)本中dMMR和PD-L1的差異性和一致性，為結(jié)直腸癌未來免疫靶向治療的精準(zhǔn)診斷提供參考。

材料與方法

一、研究對象

選取2016年1月至2017年10月在吉林省腫瘤醫(yī)院接受CRC根治性手術(shù)的患者50例，手術(shù)前均未接受任何治療，術(shù)后病理證實為TNMⅡ期結(jié)直腸癌。本研究得到吉林省腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書。入組患者基本資料：男性27例，女性23例；年齡范圍為31～65歲，中位年齡57歲；手術(shù)切除新鮮結(jié)直腸組織標(biāo)本后送病理科，以10%福爾馬林固定24 h以上，制備石蠟包塊。

二、試劑

鼠抗人MutL同源蛋白1（MutL homolog 1，MLH1）、Muts同 源 蛋 白 2（MutS homolog 2，MSH2）、Muts同 源 蛋 白 6（MutS homolog 6，MSH6）、減數(shù)分裂后分離蛋白2（Postmeiotic segregation increased 2，PMS2）單克隆抗體、HRP標(biāo)記兔鼠專用二抗和AEC顯色液均購自福建邁新公司，鼠抗人PD-L1單克隆抗體購自cell signaling technology公司，蘇木素購自中杉公司，PBS粉末和水性封片劑購自鼎國公司。

三、免疫組織化學(xué)

石蠟切片置于65℃干燥箱12 h，脫蠟返水后，采用枸櫞酸鹽緩沖液（PD-L1）和EDTA緩沖液（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）高壓抗原修復(fù)2 min，待溫度降至室溫后，應(yīng)用3%H2O2常溫避光孵育30 min去除內(nèi)源性過氧化物酶的影響，加入一抗（1:200稀釋），濕盒內(nèi)4℃孵育過夜，PBS洗3遍后加入通用二抗，37℃孵育30 min，最后采用AEC顯色，蘇木素復(fù)染細胞核5 min，封片后在顯微鏡下觀察蛋白染色情況。用已知陽性切片（肺癌）做陽性對照，陰性對照切片用PBS代替一抗。

四、判定標(biāo)準(zhǔn)

MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均定位在細胞核中，當(dāng)四個錯配修復(fù)蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均表達時，即可判定為錯配修復(fù)功能完整；四種蛋白中一種以上不表達，判定為MMR表達缺失（dMMR）。判讀標(biāo)準(zhǔn)如下：在對照組織（即腫瘤周圍的正常上皮細胞、腫瘤內(nèi)浸潤的淋巴細胞、間質(zhì)細胞均出現(xiàn)細胞核著色）中強陽性表達的前提下，只要MMR蛋白在腫瘤細胞出現(xiàn)核著色，即判定該蛋白為陽性表達；若MMR蛋白在腫瘤細胞未出現(xiàn)核著色則視為MMR蛋白缺失［5-8］。

PD-L1定位于細胞膜和細胞質(zhì)中，結(jié)果判斷采用陽性細胞半定量分級法［9］：先根據(jù)陽性細胞個數(shù)占整個腫瘤細胞的百分率計分，＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；再根據(jù)陽性細胞染色深淺計分，不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，最后將兩者分?jǐn)?shù)相乘，0分為陰性，1～4分（＋），5～8分（＋＋），9～12分（＋＋＋），以（＋）及以上表達者即統(tǒng)計為表達陽性。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，定性資料采用χ2檢驗，最小頻數(shù)（T）＜5時采用Fisher精準(zhǔn)檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、MMR在Ⅱ期結(jié)直腸癌組織中的表達情況

MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均定位在細胞核中（圖1），50例CRC組織標(biāo)本中每種蛋白表達缺失率分別為12%、6%、16%和24%，dMMR的總發(fā)生率為32%（16/50），其中，1種蛋白的缺失率占18.7%（3/16）；兩種以上蛋白的缺失率所占比例為68.7%（11/16）。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測MMR蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達。分別于200倍和400倍鏡下拍照

二、PD-L1在Ⅱ期結(jié)直腸癌組織中的表達

PD-L1陽性可表達于結(jié)直腸癌組織的細胞膜或（和）細胞質(zhì)，呈淡黃色至棕黃色細顆粒（圖2A），在50例結(jié)直腸癌組織中，PD-L1的陽性率為38%（19/50）；以肺癌組織為陽性對照（圖2C）；PD-L1陽性率隨年齡增長而增加，分別為24% vs 52%（P=0.041），但與性別、浸潤程度和分化程度等臨床病理特征均無顯著相關(guān)性（P＞0.05）（表1）。

三、PD-L1與MMR的一致性及影響因素

PD-L1在dMMR中的表達率為62.5%（10/16），明顯高于錯配修復(fù)功能完整中的表達率26.5%（9/34），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.027），見表2；PD-L1在MLH1和MSH2陰性組的表達率高于陽性組，100% vs 34%，83.3% vs 31.8%，P=0.024和0.049，但與MSH6及PMS2蛋白的表達差異則無顯著統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；PD-L1與MMR的表達一致性較差（Kappa=0.343，P=0.014）。

圖2 免疫組織化學(xué)檢測PD-L1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達。2A：PD-L1在結(jié)直腸癌組織中陽性表達；2B：PD-L1在結(jié)直腸癌組織中陰性表達；2C：PD-L1在肺癌組織中高表達（陽性對照）；分別于200倍和400倍鏡下拍照

表1 PD-L1表達與Ⅱ期結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

表2 PD-L1在MMR蛋白中的表達情況

討 論

免疫靶向藥物已被美國和歐盟批準(zhǔn)用于治療多種晚期實體腫瘤，如黑色素瘤、腎癌和非小細胞肺癌等，PD-L1的表達狀況是目前較多用于臨床實踐的免疫靶向藥物療效預(yù)測標(biāo)志物［4，10］。多項研究均提示非篩選的晚期結(jié)直腸癌患者對抗PD-1/PD-L1治療效果不佳［11-12］，因此，CRC目前仍需要明確指示藥物療效的生物標(biāo)志物。

Le等［13］認(rèn)為 KEYNOTE-028中唯一達到部分緩解的結(jié)直腸癌患者可能在基因?qū)W方面有著重要特征，并設(shè)計了一項以腫瘤基因?qū)W特征篩選患者并評估抗PD-1療效的Ⅱ期臨床試驗，研究結(jié)果提示檢測dMMR能夠預(yù)測患者抗PD-1抗體（pembrolizumab）的預(yù)后，該類型患者應(yīng)用PD1抑制劑的療效更優(yōu)。2017年美國FDA依照生物標(biāo)志物核批的抗腫瘤療法批準(zhǔn)pembrolizumab治療帶有dMMR的實體瘤患者。

腫瘤的瘤內(nèi)異質(zhì)性是導(dǎo)致耐藥的重要原因之一，當(dāng)不同的驅(qū)動基因表達不一致時，如何優(yōu)化治療方案將是未來臨床實踐的挑戰(zhàn)之一。本研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ期術(shù)后的CRC樣本中，PD-L1的表達與MMR的一致性低，但是PD-L1與dMMR的陽性人群比例相似，約為30%左右。馮穩(wěn)等［15］報道210例CRC患者（Ⅰ～Ⅳ期），其PD-L1的總陽性率為18.6%，Ⅱ期患者的陽性率為23%。本研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1的表達與年齡遞增有關(guān)（P=0.041），這與Droeser等［14］研究結(jié)果一致，他們還認(rèn)為PD-L1表達可能與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但與性別、分期和浸潤程度無關(guān)。Siddique等［16］分析1 000余例Ⅰ～Ⅳ期CRC后發(fā)現(xiàn)dMMR陽性率為15%～20%，Koopman等［17］認(rèn)為dMMR的發(fā)生率隨分期逐步下降，Weiss等［18］認(rèn)為右半結(jié)腸癌及近端結(jié)腸癌中dMMR陽性率高。本研究納入的患者為Ⅱ期患者，dMMR的發(fā)生率略高于Ⅰ～Ⅳ期的平均發(fā)生率，這可能與入組人群或患者的臨床分期相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)dMMR中PD-L1表達率高，而且與MLH1和MSH2蛋白相關(guān)。這與Kim等［19］的研究結(jié)論一致。他們檢測了203例結(jié)直腸癌患者，發(fā)現(xiàn)PD-L1的陽性表達與MLH1/MSH2缺失密切相關(guān)（P=0.01），該結(jié)果與本研究的結(jié)論一致。

本研究存在一定的局限性，包括缺少免疫靶向治療對于PD-L1和dMMR差異性和一致性表達患者的治療療效數(shù)據(jù)，此外，該研究方法只是定性檢測，缺少更精確的定量分析等。未來同一標(biāo)本中PD-L1和dMMR的大樣本、前瞻性，多平臺（既定性又定量）的檢測分析將為揭示CRC異質(zhì)性和靶向基因差異分布的個體化精準(zhǔn)治療和預(yù)后提供更多循證醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)。