陳文杰 蘇獻(xiàn)豪 王躍遷 王會鵬 葉桃 陳駿 趙加應(yīng) 蔡元坤

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的腸道惡性腫瘤，目前發(fā)病率居全球第三位，據(jù)統(tǒng)計每年超過120萬新發(fā)病例，大約60萬患者死于結(jié)直腸癌，居癌癥相關(guān)死亡第四位［1］。結(jié)直腸癌的發(fā)生涉及到多因素、多階段、多途徑，近年來有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生中扮演重要角色，并且已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)菌（產(chǎn)毒脆弱擬桿菌屬、糞腸球菌、梭桿菌屬、解沒食子酸鏈球菌等）可能是大腸致癌菌［2-5］。姜黃素是從姜黃中提取的一種天然多酚類物質(zhì)，因其具有抗炎、抗感染、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用和生物學(xué)功能［6］，近年來成為研究的熱點，本實驗擬通過監(jiān)測姜黃素干預(yù)小鼠成瘤過程中小鼠腸道菌群的變化，探究姜黃素的抗癌作用機制，及腸道菌群是否是其可能的作用靶點。

材料與方法

一、材料

實驗動物：C57BL/6小鼠，6周齡，25只，體重17～20 g，SPF級飼養(yǎng)環(huán)境，由華東師范大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2011-0031。

主要試劑：氧化偶氮甲烷、右旋葡聚糖硫酸鈉、姜黃素，均由Sigma-Aldrieh公司（美國）提供。

二、實驗方法

實驗分組及安排：25只小鼠隨機分為基礎(chǔ)飲食組（BD）5只、AOM/DSS造模組（MO）10只、姜黃素干預(yù)造模組（CU）10只，所有小鼠在同等環(huán)境下飼養(yǎng)1周后開始試驗，基礎(chǔ)飲食組全程自由飲食；造模組于1、4、7周首日腹腔注射AOM（10 mg/kg），然后自由飲用2.5%DSS藥水3天后改為自由飲水［7］；干預(yù)組在造模開始后進行姜黃素隔日灌胃（200 mg/kg）至處死。分別于實驗前和處死前收集小鼠糞便，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

DNA提取及高通量測序：采用德國QIANEN公司生產(chǎn)的QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取糞便樣品微生物的總DNA，具體步驟按照說明書操作，所提取的DNA于-80℃保存。高通量測序擴增細(xì)菌16SrRNA的421～460 bp區(qū) 域， 上 下 游 引 物 分 別 為 421F5?-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3?，460R5?-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3?。將得到的PCR產(chǎn)物構(gòu)建測序文庫，采用Illumina Miseq平臺測序，對高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析，該部分由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0軟件，計量數(shù)據(jù)以（x±s）表示，多組間差異采用方差分析，對于不滿足正態(tài)分布或方差齊性的數(shù)據(jù)采用Welch檢驗和Brown-Forsythe檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。基于樣品測序產(chǎn)生的OTU結(jié)果，采用Qiime軟件計算beta多樣性距離矩陣，并用R語言vegan軟件包作非線性多維標(biāo)度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）。

結(jié) 果

一、小鼠體重及成瘤變化

造模組與姜黃素組小鼠在后期的體重增量中，造模組小鼠體重增量平均要少于姜黃素干預(yù)組（見圖1）。在第7周處死小鼠時發(fā)現(xiàn)，姜黃素組小鼠結(jié)直腸腫瘤的成瘤數(shù)量、瘤體體積（見圖2、3），明顯小于造模組，提示在腫瘤的發(fā)生過程中，姜黃素起到了抑制腫瘤生成的作用。

二、測序序列及測序深度

在44例樣本中，總共獲得2 373 451條原始序列，經(jīng)過質(zhì)量過濾且Index完全匹配的有效序列和去除嵌合體之后的優(yōu)質(zhì)序列數(shù)為1 596 185，樣本序列長度主要集中在421～460 bp區(qū)域。為了便于進一步研究，對所有有效序列進行了OUT聚類，并按照最小樣本序列數(shù)進行了抽平，最終獲得339OUT單元。（見圖4）。

圖1 小鼠體重增長圖

圖2 造模組及姜黃素組成瘤圖片

圖3 成瘤數(shù)目及載瘤負(fù)荷圖

三、稀釋曲線及豐度分布曲線

在OUTs聚類完成的基礎(chǔ)上，我們進行稀釋曲線和豐度曲線的繪制，稀釋曲線圖中可以看出開始時曲線快速上升，說明隨測序深度增加，新發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌種類也增加；隨著測序深度增加（序列數(shù)目增多），曲線趨于平緩，當(dāng)序列數(shù)達(dá)一定數(shù)目時，基本處于平臺期，提示測序深度可以覆蓋所有細(xì)菌物種。從物種豐度曲線可以看出，相對豐度過高的菌種在各樣本中較少，隨樣本中物種組成豐富度的增加，曲線越平坦，物種組成的均勻度也就越高，不同樣本在不同的豐度達(dá)到平臺期，多數(shù)樣品所測得OTUs豐度在10至200區(qū)間。見圖5。

四、Alpha多樣性分析

通過組間差異檢驗可以看出，T1點（干預(yù)前）時各組小鼠的多樣性指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，T2點（干預(yù)后）時MO組的多樣性指數(shù)更高，高于其他2組，與BD組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.73，P=0.02），與CU組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見表1、2）。另外可以看出T2點時各組的多樣性指數(shù)均較T1點時明顯升高，其中CU組與BD在T2點時多樣性指數(shù)更接近，均小于造模組，提示化學(xué)誘導(dǎo)成瘤過程中，小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變動，而姜黃素能維持腸道菌群相對穩(wěn)定。

五、各組在門水平的比較分析

對優(yōu)質(zhì)序列按照不同相似程度進行聚類獲得OUTs，每一OUT中選一條代表性序列同已知數(shù)據(jù)庫比對、注釋分析，獲得該序列代表的細(xì)菌信息。分別按門（Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Family）、屬（Genus）水平統(tǒng)計結(jié)果。圖6為各小鼠腸道菌群在菌門（Phylum）水平構(gòu)成的柱狀圖?？梢钥闯龈鹘M小鼠腸道菌群在門水平有其特異性，但是擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）以及變形菌門（Proteobacteria）為主要優(yōu)勢菌門。其他如放線菌門（Actinobacteria）、柔膜菌門（Tenericutes）也存在于大部分樣品中，但豐度均小于1%。另外可以看出優(yōu)勢菌門的物種在干預(yù)前后發(fā)生了變化，為了更直觀準(zhǔn)確的對比菌群的變化，我們對基礎(chǔ)組、造模組和姜黃素組小鼠腸道菌群在門水平上進行了對比分析統(tǒng)計（見圖7），從統(tǒng)計圖中我們可以直觀的看出，基礎(chǔ)飲食組的腸道菌群在測序前后無明顯變化，排除了飼養(yǎng)環(huán)境引起的菌群變化因素；造模組和基礎(chǔ)飲食組干預(yù)前后腸道菌群在門水平?jīng)]有明顯變化，而姜黃素組改變較大，表現(xiàn)為干預(yù)后擬桿菌門（Bacteroidetes）增加，厚壁菌門（Firmicutes）減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），另外疣微菌門（Verrucomicrobia）、變形菌門（Proteobacteria）以及放線菌門（Actinobacteria）干預(yù)后也有少量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)后造模組與姜黃素組對比，姜黃素組擬桿菌門（Bacteroidetes）較少，疣微菌門（Verrucomicrobia），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 序列長度分布圖

圖5 稀釋曲線及豐度分布曲線圖

表1 T1點（干預(yù)前）Alpha多樣性指數(shù)表

表2 T2點（干預(yù)后）Alpha多樣性指數(shù)表

圖6 門水平小鼠腸道菌群柱狀圖

六、各組在屬水平的比較分析

從菌屬水平可以看出，造模組與姜黃素組干預(yù)前后菌屬發(fā)生了很大改變，造模組干預(yù)前后變化有統(tǒng)計學(xué)意義的菌屬有：Blautia（P＜0.05）、Unclassif i ed_f__Enterobacteriaceae（P ＜ 0.01）、Parabacteroides（P ＜ 0.001）、unCUltured_f__Ruminococcaceae（P ＜ 0.01）、Lactobacillus（P＜0.05），姜黃素組干預(yù)前后變化有統(tǒng)計學(xué)意義的菌屬有：norank_f__Bacteroidales_S24-7_group（P＜0.001）、Akkermansia（P＜0.05）、Blautia（P＜0.01）。為了進一步觀察造模組和姜黃素組干預(yù)后菌屬有無區(qū)別，我們對二者進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Akkermansia在姜黃素組富集，而Parabacteroides在造模組富集，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖8。

討 論

近年來，從中藥中分離提取有效成分進行抗癌研究逐漸成為研究熱點，姜黃素便是其中之一。既往的研究表明，姜黃素具有抗炎、抗腫瘤等作用。眾所周知，腸炎是引起腸癌的重要原因之一。姜黃素作為一種較安全的中藥成分，人們在之前就已經(jīng)開始了姜黃素作用于腸炎的研究［8］，作為對現(xiàn)有治療的補充。但是，姜黃素生物利用度非常低，限制了它作為藥物的應(yīng)用。

近年來，隨著腸道菌群的改變對腸癌發(fā)生發(fā)展的研究越來越多，人們意識到腸癌的發(fā)生和腸道菌群也有著密不可分的關(guān)系［9-10］，口服姜黃素生物利用率低，但是在腸道內(nèi)，姜黃素與腸道菌群直接作用，我們猜想姜黃素會與腸道菌群互相作用從而調(diào)節(jié)腸道菌群的構(gòu)成，以此來進行對腸炎腸癌的預(yù)防。通過使用經(jīng)典的造模方法，同時在造模的基礎(chǔ)上進行姜黃素的干預(yù)，我們設(shè)計了此實驗，并且通過高通量測序的方法，證明了姜黃素在預(yù)防腸癌的發(fā)生發(fā)展上，確實調(diào)整了腸道菌群的構(gòu)成，并在一定程度上維持了腸道菌群的穩(wěn)定。相比于造模組小鼠，姜黃素組小鼠的腸道菌群雖然在主要菌群中有比較大的變化，但是在種屬的分析上，我們可以看出，造模組的小鼠腸道菌群變化更大，而在姜黃素干預(yù)組小鼠變化中，我們可以看到屬于疣微菌門（Verrucomicrobia）的艾克曼菌（Akkermansia）有明顯的增加，在最近的研究中［11］已經(jīng)確認(rèn)艾克曼菌（Akkermansia）對于減少腸道炎癥有很重要的作用，通過我們的數(shù)據(jù)，我們可以認(rèn)識到，姜黃素通過增加艾克曼菌抑制腸道炎癥從而減少腸癌的發(fā)生。但同時我們也可以看到，在我們的測序數(shù)據(jù)里面，最主要的擬桿菌屬發(fā)生了非常大的變化，而造模組的擬桿菌屬的變化卻沒有姜黃素組這么劇烈。結(jié)合我們既往的研究［12］，推斷在造模成瘤的過程中，產(chǎn)毒脆弱擬桿菌屬在造模組中占據(jù)了主要地位，造成腸癌的發(fā)生，而姜黃素組抑制了此類菌種在腸道菌群中的組成，從而進一步抑制腸癌的發(fā)生。由于測序深度有限，我們無法在此文中給出確切的數(shù)據(jù)來證明我們的猜想。但是結(jié)合既往的研究結(jié)果，我們不難推斷出我們的實驗從一個基本面上證明了我們的猜想。綜合上述結(jié)果，我們可以認(rèn)為，姜黃素一方面通過盡量維持腸道菌群的穩(wěn)定性來減少腸癌的發(fā)生，另一方面，姜黃素也通過增加腸道內(nèi)的益生菌，抑制有害菌屬的增加來抑制腸炎的發(fā)生發(fā)展，從而進一步的抑制腸癌的發(fā)生發(fā)展。

圖7 各組門水平小鼠腸道菌群差異圖。7A：BD組干預(yù)前后門水平菌群差異；7B：CU組干預(yù)前后門水平菌群差異；7C：MO組干預(yù)前后門水平菌群差異；7D：CU組與MO組干預(yù)后門水平菌群差異

圖8 各組屬水平小鼠腸道菌群差異圖。8A：MO組干預(yù)前后屬水平菌群差異；8B：CU組干預(yù)前后屬水平菌群差異；8C：CU組與MO組干預(yù)后屬水平菌群差異

綜上，本研究通過小鼠結(jié)直腸癌模型，初步探究了姜黃素可能的抑癌機制，為結(jié)直腸癌與腸道菌群相關(guān)性的研究提供了新思路。