孟文建 王自強 于永揚 孫曉峰 周總光

大腸癌（colorectal cancer，CRC）包括結腸癌和直腸癌，是威脅人類健康的常見腫瘤之一。在中國，約70%～75%的直腸癌為中低位直腸癌，手術是主要的治療手段。然而，即使有了全直腸系膜切除（total mesorectal excision，TME）的手術方式，但仍30%的局部進展期直腸癌患者可能環(huán)周切緣陽性，從而導致腫瘤復發(fā)［1］。術前新輔助放療也已成為進展期中低位直腸癌治療的標準方案，但術前放療面臨的最大的挑戰(zhàn)是直腸腫瘤對放療的敏感性存在較大的差異。因此，深入了解腫瘤放射敏感性的機制，有助于尋找預測放療敏感性的分子標記，從而實現對患者的個性化篩選。SATB1作為染色質高級結構形成的基礎，被稱為“基因組組織者”，它能調控超過10%的基因，這些基因的功能復雜多樣，從而表明SATB1基因的功能多樣性［2］。近年來，SATB1在腫瘤中的重要作用備受關注，眾多研究證實SATB1與喉癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和（或）轉移有關［3-7］。我們前期的研究結果［8］首次證實SATB1表達與直腸癌的進展有關。除了在腫瘤中的重要作用外，SATB1在治療方面的價值，特別是對放化療的反應性，日益受到人們的關注。本研究通過分析SATB1表達與預后及放療相關因子的關系，探討SATB1在直腸癌新輔助放療中的作用。

資料與方法

一、一般資料

本研究選取142例參與瑞典術前放療研究（Stockholm Trial I）的直腸癌患者作為研究對象，其中68例接受術前短程放療（5 Gy/次，共25 Gy）（RT組），74例未接受術前放療（non-RT組），包括直腸癌組織（n=142）和相應的正常黏膜組織（n=107）、術前活檢癌組織（n=84）以及轉移淋巴結（n=43）。所有患者無局部手術或化療病史，且術前經影像學檢查排除遠處轉移。其中男性80例，女性62例。年齡37～75（中位年齡57歲）。放療結束1周后手術，患者新輔助放療前活檢及術后切除腫瘤組織、正常組織以及轉移淋巴結標本均經病理學檢測確診。兩組患者的基線特征無統(tǒng)計學差異（P＞0.05，表1）。中位隨訪期為75個月（0～193個月）。本研究得到了瑞典和四川大學倫理審查委員會的批準。

表1 患者及腫瘤的臨床病理特征

二、免疫組織化學染色

收集的直腸癌組織和相應的正常黏膜組織、術前活檢癌組織以及轉移淋巴結組織經10%甲醛固定，石蠟包埋，使用手動點樣儀（英國Beecher公司）構建組織芯片。從每個切片中選取3個形態(tài)學上有代表性的區(qū)域，并從中取3條柱形中心組織（直徑0.6 mm）包埋進蠟塊中，使用顯微薄片切片機5 um厚度切片，固定于載玻片。將組織芯片置于二甲苯脫蠟、乙醇再水化，然后雙蒸水洗滌。使用高壓鍋在125℃沸水中抗原修復切片30 s，置于1×DIVA緩沖液中煮沸（125 ℃，30 s），自然冷卻20 min以上，至室溫，PBS沖洗3次，每次5 min。切片經3%過氧化氫-甲醇液孵育5 min以阻斷內源性過氧化物酶活性。PBS沖洗后，正常羊血清工作液37 ℃封閉10 min，傾去勿洗，滴加適當比例稀釋的兔抗-SATB1單克隆抗體（1：250；Epitomics），4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5 min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照）。滴加生物素標記的二抗（Dakocytomation）37 ℃孵育25 min，PBS沖洗。滴加DAB顯色2～10 min，顯微鏡下觀察，有棕黃色沉淀物，即自來水沖洗，終止反應。最后，蘇木素復染3～5 min，鹽酸酒精分化1～2 s，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。

三、免疫組化結果判定

使用奧林巴斯DD70BX51采集圖像，細胞核出現棕黃色顆粒為陽性。于高倍顯微鏡（×400）下，每張切片隨機取10個視野，每個視野觀察100個細胞，取其平均值。根據染色的強度及切片陽性細胞率判斷結果，染色強度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分和棕褐色為3分；陽性細胞率：無為0分，＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分。上述兩項指標相乘后獲得總評分0～9分：0分為陰性，1～2分為弱，3～6分為中，7～9分為強。由2個研究者獨立進行閱片和評分，總評分為陰性或弱者為弱表達，總評分為中和強的病例為強表達。

四、放療相關因子的表達

我們以前在本研究使用的這些標本中采用免疫組化染色檢測了一些與放療有一定相關性的指標，包括 Necrosis（n=134）［9］、Ki-67（n=114）［10］、p53（n=134）［11］、p73（n=120）［12］、ATM（n=168）［13］、FXYD-3（n=123）［14］、pRb2/p130（n=80）［15］、MAC30（n=115）［16］、TEM1（n=119）［17］和Survivin（n=89）［18］。

五、網絡分析

通 過 Ingenuity通 路 分 析（IPA，Ingenuity?Systems，Mountain View，CA；www.ingenuity.com）評估SATB1的功能重要性。將相互作用基因（包括SATB1）的基因銀行ID上傳到IPA，然后IPA將其映射至Ingenuity通路知識庫（IPKB）中的功能性網絡。與整個IPKB進行對比，分配給焦點基因功能的生物學功能構成了網絡。

六、蛋白-蛋白相互作用分析

蛋白-蛋白相互作用分析用于發(fā)現蛋白質之間的可能相互作用。首先從UniProt數據庫下載SATB1（UniProt ID：Q01826），pRb2/p130（UniProt ID：Q08999）和TEM1（UniProt ID：Q9HCU0）的氨基酸序列，然后將這些序列呈遞給I-TASSER服務器并下載計算出來的最優(yōu)模型。C-評分最好在2到-1.5。然后獲得的結構在NIH-SAVES服務器上進行驗證并呈遞給Z-DOCK服務器以獲得相互作用模型。在Swiss-PDB閱讀器里，每個蛋白和復合物的能量被最小化。最后在Swiss-PDB閱讀器中計算出復合物和每個獨立鏈的能量，并從兩個蛋白的能量之和中減去復合物能量來評分結合的自由能。從POPS服務器計算每個蛋白和復合物的可及表面積（ASA），然后從每個蛋白ASA之和中減去復合物ASA來計算ΔASA。

七、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，組間率的比較采用卡方檢驗或確切概率法檢驗，SATB1與總生存期（overall survival，OS）、無病生存期（disease-free survival，DFS）以及復發(fā)的關系采用Cox回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、SATB1在不同組織中的表達情況

在未接受術前放療的患者中，SATB1從正常組織（16/68；24%）到原發(fā)腫瘤（31/74；42%）表達升高（χ2=5.396，P=0.032），而從腫瘤到淋巴結轉移（4/27；15%）表達降低（χ2=6.405，P=0.022，圖1A）。在接受術前放療的患者中，SATB1在正常黏膜（12/61；20%）、原發(fā)腫瘤（14/68；21%）以及淋巴結轉移（3/16；19%）中的表達差異無明顯的統(tǒng)計學意義（P＞0.05；圖1B）。

圖1 SATB1在直腸癌患者中的表達情況。1A：在未接受術前放療的患者中，SATB1從正常組織到腫瘤表達升高，而從腫瘤到淋巴結轉移表達降低（*P＜0.05）；1B：在接受術前放療的患者中，SATB1從正常組織、腫瘤到淋巴結轉移的表達無明顯變化

二、SATB1表達與預后的關系

在接受術前放療的患者中，SATB1的表達與不良的OS（P=0.015）和DFS（P=0.021，圖2A、2B）相關，獨立于性別、年齡、TNM分期和腫瘤分化程度（OS：HR，0.516；P=0.039；95% CI：0.274～0.969；DFS：HR，0.558；P=0.025；95% CI：0.335～0.930，表2）。然而，SATB1表達與局部復發(fā)和遠處轉移無關（P=0.261，P=0.056；圖2C、2D）。在未接受放療的患者中，單因素及多因素分析均顯示SATB1表達與預后無關。這些結果提示SATB1表達可以獨立用于預測接受術前放療直腸癌患者的預后。

三、放療對腫瘤組織中SATB1表達的影響

與未放療的直腸癌組織比較，放療后SATB1表達明顯下降（42% vs. 21%，P=0.011）；放療后SATB1在腫瘤組織中的表達低于術前活檢癌組織（40% vs. 20%，P=0.042，圖3）。

四、SATB1與放療相關因子的關系

我們將以前采用相同放療標本檢測的一些放療有關因子（包括ATM、FXYD-3、MAC30、pRb2/p130、Ki-67、Survivin等）的數據，與SATB1表達進行比較。結果顯示在這些放療的直腸癌患者中，腫瘤組織中SATB1高表達，與ATM和pRb2/p130低表達（χ2=5.427，P=0.032；χ2=4.610，P=0.047），而與Ki-67和TEM1表達均需一致（χ2=4.339，P=0.037；χ2=7.376，P=0.014），見表 3。最后，我們通過Ingenuity通路分析（IPA）分析SATB1與這些放療相關因子的可能網絡關系，顯示這些蛋白可能通過一些放療反應相關的信號通路（圖4），比如NF-κB通路、BRCA1介導的DNA損傷反應通路以及細胞周期調控的G1/S檢測點通路，從而在放療反應機制中發(fā)揮重要的作用。進一步，我們檢測了SATB1蛋白與TEM1和pRb2/p130蛋白的相互作用。結果顯示SATB1-TEM1和SATB1-pRb2/p130復合物的ΔASA分別為4513.4 ?2和4286.3?2，結合自由能分別是-432.18 kcal/mol和-637.482 kcal/mol。在SATB1-TEM1復合物內有8個氫鍵（圖5A），而SATB1-pRb2/p130復合物有17個氫鍵（圖5B）。這些復合物以極性界面為主要特征，表明這些復合物非強制性的結合本質。

圖2 接受術前放療直腸癌患者中SATB1表達與生存和復發(fā)的關系。2A：OS；2B：DFS；2C：局部復發(fā)；2D：遠處轉移

表2 接受術前放療直腸癌患者OS和DFS的多因素分析

討 論

目前，術前放療已經作為進展期直腸癌綜合治療的重要組成部分，均推薦對局部晚期直腸癌給予術前放療［19-20］。術前放療面臨的最大的挑戰(zhàn)是進展期直腸癌對放療的敏感性存在較大的差異，因此找到預測放療敏感性的標記物可以說是走向直腸癌個體化治療的關鍵一步［21］。

SATB1作為染色質高級結構形成的基礎，在染色體重塑、轉錄調節(jié)、胸腺發(fā)育、T淋巴細胞成熟等方面發(fā)揮重要的作用［22-25］。SATB1能將多個遠程靶序列固定在“蛋糕樣”網絡中并使它們聚集在一起，形成染色質環(huán)結構，并將染色質重構和轉錄因子招募給靶基因，從而在T細胞中行使遠程的基因表達調控子的功能［25-27］。SATB1能調控超過10%的基因，這些基因的功能復雜多樣，從而表明SATB1基因的功能多樣性。眾多研究證實SATB1與喉癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和（或）轉移有關［3-7］。我們前期的研究結果［8］首次證實SATB1表達與直腸癌的進展有關。本研究中，在未接受術前放療的患者中，SATB1從正常組織到原發(fā)腫瘤表達升高，而從原發(fā)腫瘤到淋巴結轉移表達降低，顯示SATB1在直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

圖3 術前放療對直腸腫瘤SATB1表達的影響 圖4 網絡分析。SATB1分子網絡示意圖。在網絡中，結代表蛋白，線代表蛋白間的聯系。紅色的結表示上調，綠色的結表示下調，結的形狀代表蛋白的分子類型圖5 蛋白-蛋白相互作用分析。5A：SATB1（淺綠色）與TEM1（青色）復合物的可能構象；5B：SATB1（淺綠色）與pRb2/p130（青色）復合物的可能構象；彩球代表氫鍵

表3 接受術前放療的直腸癌患者SATB1表達與生物學因子的關系（例，%）

除了在腫瘤中的重要作用外，SATB1在治療方面的價值，特別是對放化療的反應性，日益受到人們的關注。DNA是放射線作用的關鍵靶點，DNA損傷與修復之間此消彼長的動態(tài)關系是影響腫瘤放療敏感性的關鍵因素。一些DNA損傷和修復相關的基因，也是SATB1調控的靶基因，如DNA損傷誘導轉錄因子4（DDIT4）、DNA損傷檢測點介質1（MDC1）、復制因子C4（RFC4）、聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶-1（PARP1）、TREX2、染色質組裝因子1A（CHAF1A）等［28］。SATB1在T細胞中介導DNA損傷位點的裝配，SATB1結構體系可在基因調控時為染色質/轉錄因子的重建提供平臺。Li等［29］發(fā)現在低劑量X射線所致的DNA損傷時，SATB1能招募DNA修復蛋白，顯示其在DNA損傷修復中的重要作用。本研究結果顯示在接受術前放療的患者中，SATB1的表達與這些患者不良的生存獨立相關，與局部復發(fā)和遠處轉移無關。提示SATB1表達可以獨立用于預測接受術前放療直腸癌患者的預后。進一步，我們比較了放療后SATB1的表達變化情況，結果顯示與未放療的直腸癌組織比較，放療后SATB1表達明顯下降；同樣，放療后SATB1在腫瘤組織中的表達明顯低于術前活檢癌組織。提示在放療過程中，腫瘤細胞在啟動細胞周期阻滯、凋亡、DNA損傷修復等復雜的生物學反應過程中，也出現了SATB1表達的降低，可能在于放療通過降低SATB1表達觸發(fā)了其下游調控機制，通過靶基因的調節(jié)來介導腫瘤細胞對放療的反應性。

理論上，放療可誘導多種多樣基因的轉錄，因此調制基因表達被認為有助于細胞放射反應。這樣，放療誘導的基因表達可構成對放療的適應性或保護性反應，導致細胞損傷或死亡。因此，我們將以前采用相同標本檢測的一些放療有關因子的數據，與SATB1表達進行比較，以探究SATB1在直腸癌放療反應中的作用。結果發(fā)現，在放療的直腸癌患者中，腫瘤組織中SATB1的表達與ATM和pRb2/p130表達負相關，而與Ki-67和TEM1表達正相關。近來的研究顯示乳腺癌許多與腫瘤發(fā)生各個方面有關的基因，包括ATM、Survivin和pRb2/p130，均受SATB1表達的調控。另外，SATB1可直接或間接調控其靶基因，而在肝癌和結直腸癌中這些靶基因與乳腺癌中的許多靶基因相互重疊［30-31］。因此，SATB1在直腸癌中有可能像在乳腺癌中那樣影響同一類基因。這些相關的結果指向一個機制，即在放療中這些基因可能以SATB1-依賴的方式受到調控。隨后，我們采用IPA從IPKB構建SATB1調控蛋白的網絡，結果證實了SATB1與這些放療反應蛋白之間的直接相互聯系的網絡。網絡顯示這些蛋白可能通過一些放療反應相關的信號通路，比如NF-κB通路，BRCA1-介導的DNA損傷反應通路以及細胞周期調控的G1/S檢測點通路，從而在放療反應機制中發(fā)揮重要的作用。在這些網絡中，Ki-67被上調，而ATM和pRb2/p130被SATB1下調，這與我們研究結果中SATB1和這些生物學因子的關系是一致的。另外，網絡也顯示SATB1通過其他通路上調ATM。在這個網絡中，未觀察到SATB1與TEM1的直接聯系，這可能在于這種關系尚未被報道，而IPA是基于發(fā)表文獻中的信息來搜索分子間聯系的。在一個隨機選擇基因座（包含SATB1-上調和下調基因）的研究中，所有體內結合SATB1均位于其預測的堿基解配對區(qū)，而那些不依賴于SATB1的基因均不與SATB1結合，即使這些基因座有多個堿基解配對區(qū)［32］。因此，我們通過蛋白-蛋白相互作用分析來檢測SATB1與TEM1和pRb2/p130的相互作用，以驗證網絡分析中所檢測的聯系。蛋白-蛋白相互作用預測是一個聯合生物信息學和結構生物學的領域，試圖證實和分類蛋白對或蛋白組之間的物理相互作用。這些相互作用的信息可提高我們對疾病的認識，并能為新的治療方法提供理論基礎。ΔASA代表復合物和單個分子在水中的差異，為蛋白-蛋白的幾何契合提供信息。事實上，高ASA是分子間更高的形態(tài)互補的征象。而且，所觀察到的自由結合能也支持復合物的穩(wěn)定形成。這些特征顯示SATB1與這些蛋白的結合可能性。雖然這些相互作用僅僅是預測的結果，但本研究中蛋白-蛋白的相互影響是基于共表達、蛋白結構特征和網絡拓撲結構數據，這些證據是非常充分的。