沈敏娜 戴 謙 周佳燁 王蓓麗 郭 瑋 潘柏申

(復旦大學附屬中山醫(yī)院檢驗科 上海 200032)

2012年,全球新增惡性腫瘤病例約1 410萬,死亡病例820萬[1]。相比2010年的全球癌癥統(tǒng)計報告,惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率都呈現(xiàn)快速上升的態(tài)勢[2]。其中,肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤的死亡率位居前列[1],通常手術(shù)切除原發(fā)腫瘤是首選治療方案,但即便是順利切除腫瘤,仍有很多患者最終死于腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。病理組織活檢是腫瘤診斷的金標準,但不適用于術(shù)后監(jiān)測,影像學檢查適用于術(shù)后隨訪,但很難發(fā)現(xiàn)早期微小轉(zhuǎn)移病灶。

在原發(fā)腫瘤形成和生長的早期,循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)即可從原發(fā)腫瘤脫落,并進入血流循環(huán),在遠處播散、種植,形成轉(zhuǎn)移灶。CTC被認為是“液體活檢”,具有實時監(jiān)測功能,是一種非侵入性的新型診斷標志,有助于腫瘤微轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)和預后評估,在治療監(jiān)測及個體化治療中具有重要臨床意義[3]。

但是CTC存在于大量血細胞背景之中,在不同腫瘤之間、不同患者之間,甚至是同一患者不同時期都可能存在極大的異質(zhì)性,因此分離和檢測CTC都面臨極大的技術(shù)挑戰(zhàn)。2004年,CellSearch系統(tǒng)成為FDA批準用于計數(shù)7.5 mL全血中的循環(huán)腫瘤細胞(CTC7.5)的唯一方法。第一階段使用CellSearch系統(tǒng)的臨床研究數(shù)據(jù)表明[4],CTC與轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌和去勢抵抗性前列腺癌預后不良相關(guān)。后期研究表明[5],CTC也與小細胞肺癌和非小細胞肺癌、膀胱癌、胰腺癌、頭頸部癌、卵巢癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤和肝細胞肝癌相關(guān)。

現(xiàn)有基于CellSearch平臺的文獻報道一般僅關(guān)注CTC的數(shù)量及其臨床價值,往往忽略了該平臺可以觀察到的CTC形態(tài)特征,本文以CellSearch系統(tǒng)為例來討論CTC的形態(tài)學特征及其臨床應用價值。

資 料 和 方 法

研究對象回顧性分析復旦大學附屬中山醫(yī)院檢驗科2014年12月至2016年4月期間申請CellSearch系統(tǒng)檢測CTC、經(jīng)病理活檢確診并有病史資料的惡性腫瘤患者481例,包括肝癌331例、胃癌51例、結(jié)直腸癌38例、乳腺癌35例、胰腺癌17例、肺癌5例、前列腺癌4例,其中肝癌患者連續(xù)監(jiān)測隨訪時間更新至2018年4月,將未發(fā)現(xiàn)復發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的患者定義為無進展。根據(jù)CTC檢測時是否接受外科手術(shù)治療,將患者分為術(shù)前組和術(shù)后組。

檢測方法CTC檢測系統(tǒng)采用CellSearch系統(tǒng)[強生(上海)醫(yī)療器械有限公司],檢測試劑采用其配套的CTC試劑盒。使用專用的 CellSave 儲存管(添加細胞防腐劑)采集外周血并取7.5 mL全血制備樣本。將制備好的血液及緩沖液樣本放置在CellTracks AutoPrep自動化裝置中,進行細胞富集和分離,隨后進行磁孵育。將MagNest裝置富集后的CTC進行免疫熒光染色,通過CD45抗體、細胞角蛋白(CK)8,18,19抗體與細胞核DAPI熒光染色試劑共同識別CTC。CTC檢測結(jié)果經(jīng)CellTracks Analyser Ⅱ系統(tǒng)分析后,由兩位工作人員獨立進行判讀。

統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。 計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率檢驗,生存時間分析采用Kaplan-Meier法,生存曲線的比較采用log-rank檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

7類腫瘤術(shù)前術(shù)后CTC7.5檢出率變化術(shù)前組CTC7.5(圖1):肝癌檢出率53%,中位檢出數(shù)1(0～94)個;胃癌檢出率73%,中位檢出數(shù)2(0～42)個;結(jié)直腸癌檢出率64%,中位檢出數(shù)1(0～11)個;乳腺癌檢出率85%,中位檢出數(shù)2(0～322)個;胰腺癌檢出率62%,中位檢出數(shù)1(0～5)個;前列腺癌檢出率100%,中位檢出數(shù)32(3～35)個。術(shù)后組CTC7.5檢出率為0～37%。術(shù)前組CTC7.5檢出率居前的是前列腺癌和乳腺癌,術(shù)后組CTC7.5檢出率均有顯著下降(P均<0.05)。因術(shù)后組檢測例數(shù)過少,肺癌和前列腺癌未檢測到CTC,其他腫瘤術(shù)后組CTC7.5檢出率下降最為顯著的是乳腺癌和胃癌(χ2=9.12,P=0.003;χ2=5.76,P=0.016)。

圖1 7類腫瘤術(shù)前術(shù)后CTC7.5檢出率變化Fig 1 Preoperative and postoperative CTC7.5 detection rate in 7 types of cancer

7類腫瘤CTC的形態(tài)差異觀察7類腫瘤的CTC形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)(圖2):胃癌、乳腺癌、胰腺癌多見CK強陽性CTC;肝癌、胃癌、肺癌可見體積較小CTC;不同類型腫瘤CTC形態(tài)特征存在極大異質(zhì)性;同類腫瘤CTC體積、核質(zhì)比、細胞形態(tài)、染色強度等亦存在較大差異,其中尤以肝癌和肺癌為甚。

圖2 7類腫瘤CTC的典型形態(tài)Fig 2 Typical cell morphology of CTC in 7 types of cancer

6例肝癌患者CTC連續(xù)監(jiān)測典型形態(tài)變化6例肝癌患者CTC典型形態(tài)變化特征見圖3,CTC數(shù)量及形態(tài)特征與治療反應及預后關(guān)系見圖4。基于CTC形態(tài)變化特征將患者分為4個亞組。

圖3 肝癌患者CTC形態(tài)變化Fig 3 Morphological changes of CTC in patients with liver cancer

CTC體積變化組 治療反應及預后好?；颊?連續(xù)4次監(jiān)測CTC,2次檢出CTC,體積變化較大。6-a CTC細胞體積大,核質(zhì)比小;6-b CTC細胞體積小,核質(zhì)比大。該患者術(shù)前未檢出CTC,手術(shù)導致CTC的大量釋放,在隨后的1周內(nèi)CTC7.5已大幅下降,在第1次化療后CTC已被清除,該患者目前未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移復發(fā)?；颊?5連續(xù)3次監(jiān)測CTC,2次檢出CTC,體積變化較大。25-a CTC細胞體積較小,25-b CTC細胞體積明顯增大。該患者術(shù)前CTC7.5為2個,術(shù)后1周逐漸下降為0,該患者目前未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移復發(fā)。

CTC體積穩(wěn)定組 治療反應不佳,CTC清除周期延長或預后不良?；颊?3連續(xù)5次監(jiān)測CTC,3次檢出CTC,體積基本沒有變化。該患者為肝癌術(shù)后復發(fā),CTC7.5為2個,肝移植術(shù)后降為0,但1個月后又檢出CTC,經(jīng)過2次化療降為0,該患者目前未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移復發(fā)?；颊?07連續(xù)2次監(jiān)測CTC,均檢出CTC,體積無明顯變化。該患者為肝癌綜合治療后復發(fā),CTC7.5為4個,經(jīng)多次化療和TACE治療4個月后CTC7.5為7個,電話隨訪該患者復發(fā)。

CK染色增強組 CK表達增加提示預后不良[10-12]?；颊?9連續(xù)3次監(jiān)測CTC,2次檢出CTC,體積變化不大,但第2次檢出的CTC CK染色明顯增強。該患者肝癌術(shù)后第1次化療后CTC7.5為4個,第3次化療后雖然CTC數(shù)量下降,但檢出的CTC CK染色明顯增強,第4次化療后CTC清除,但2個月后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。

CTC凋亡組 預后良好?；颊?34連續(xù)3次監(jiān)測CTC,2次檢出CTC,形態(tài)變化明顯,第2次檢出的CTC可見碎裂的CK呈小圓囊泡狀環(huán)繞核周,說明這些細胞正在走向凋亡。該患者肝移植術(shù)后18天CTC7.52個,第1次化療后CTC7.5仍為2個,但觀察第2次檢出的CTC發(fā)現(xiàn)細胞正在走向凋亡,該患者目前未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移復發(fā)。

不同亞組CTC患者無進展生存曲線比較Kaplan-Meier生存分析表明,CTC體積穩(wěn)定組(n=11)的無進展生存率顯著低于CTC體積變化組(n=9)(27.3%vs.77.8%,P=0.0405,圖5A);CK染色增強組(n=8)的無進展生存率顯著低于無CK染色增強組(n=18)(0vs.88.9%,P<0.000 1,圖5B);無CTC凋亡組(n=18)的無進展生存率顯著低于CTC凋亡組(n=4)(16.7%vs.100.0%,P=0.009 6,圖5C)。以上結(jié)果提示以CTC形態(tài)特征為基礎(chǔ)的CTC亞組(包括CTC體積變化、CK染色增強、CTC凋亡)可能與肝癌患者的臨床預后相關(guān)。

討 論

CTC作為“液體活檢”標志用于腫瘤患者實時動態(tài)監(jiān)測。隨著分離、富集和檢測技術(shù)的發(fā)展,已有多種平臺可用于檢測外周血中的CTC。由于無法進行標準化,不同平臺CTC報道的數(shù)量變化范圍很大,本文回顧性分析的數(shù)據(jù)也顯示CellSearch系統(tǒng)的CTC檢出率確實與其他平臺報道的數(shù)據(jù)有一定差異[4,6-7]。

No recurrence:Patient 6,25,63 and 134;Metastasis:Patient 99;Recurrence:Patient 107.

圖4肝癌患者治療反應CTC連續(xù)監(jiān)測
Fig4CTCdetectionoftreatmentresponsesurveillanceinpatientswithlivercancer

圖5 不同亞組CTC患者的無進展生存曲線Fig 5 Progression-free survival curve of different CTC subgroups

CellSearch系統(tǒng)是唯一被FDA批準用于臨床檢測轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌患者外周血CTCs[8]的檢測平臺,CellSearch系統(tǒng)由專用的CellSave儲存管、血樣處理設備 AutoPrep系統(tǒng)、掃描和分析樣本的Analyzer系統(tǒng)以及配套的試劑盒等部分組成,是目前國際上最為穩(wěn)定和可靠的CTC檢測系統(tǒng)。AutoPrep系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)復雜樣本處理流程的自動化和標準化。Analyzer系統(tǒng)是一種熒光光學系統(tǒng),可對經(jīng)過免疫磁性分選的CTC進行全自動掃描,并進行全自動背景分析,以圖庫形式呈現(xiàn)備選的熒光檢測圖像,最終經(jīng)人工判讀確定CTC報告數(shù)量。

目前CellSearch系統(tǒng)定義一個CTC的基本條件需要有細胞核(DAPI染色陽性)、CK+、CD45-(排除白細胞背景干擾)、面積大于4 μm×4 μm,具有細胞形態(tài)和免疫學特征。但當著眼于CTC的形態(tài)特征時,發(fā)現(xiàn)腫瘤患者自身和不同患者之間,CTC都具有很大的異質(zhì)性[4]。不同腫瘤之間CTC的形態(tài)差異也很大,例如胃癌、乳腺癌、胰腺癌多見大體積、CK染色強陽性CTC,結(jié)直腸癌、前列腺癌也多見大體積CTC;而肝癌、肺癌多見小體積CTC,且細胞形態(tài)異質(zhì)性程度更高。根據(jù)我們觀察CTC細胞形態(tài)的經(jīng)驗,在判定不同腫瘤或不同患者CTC時,即使?jié)M足CellSearch系統(tǒng)CTC的基本定義,CTC形態(tài)的異質(zhì)性仍會給判讀造成一定困難。因此,即便使用相同的CellSearch系統(tǒng),由于沒有指南明確規(guī)定詳細的CTC判讀標準,加之判讀人員對形態(tài)的理解、認知、經(jīng)驗等方面的差異,不同實驗室CTC報告數(shù)量仍可能存在一定差異。CellSearch系統(tǒng)雖然只報告CTC數(shù)量,但人工判讀部分完全基于細胞形態(tài)特征,因此我們對于細胞形態(tài)的探討有助于積累更多的經(jīng)驗,減少判讀差異,以期最終形成統(tǒng)一的判讀標準。

基于CellSearch系統(tǒng),通常認為CTC數(shù)量與預后相關(guān),CTC數(shù)量越多,預后越差[7,9]。在肝癌患者治療監(jiān)測過程中,我們發(fā)現(xiàn)同一患者的CTC形態(tài)也是不斷變化的,而且這種變化可能與治療反應及預后密切相關(guān)。我們連續(xù)監(jiān)測肝癌患者的CTC形態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)CTC體積變化、CK染色增強、凋亡CTC的出現(xiàn)可能與肝癌患者的治療反應及臨床預后相關(guān)。本文隨訪數(shù)據(jù)顯示,若治療過程中,肝癌患者CTC體積發(fā)生明顯變化,提示治療可能有效;反之,則提示CTC對治療反應不佳,清除CTC的周期延長,甚至預后不良。鑒于隨訪患者數(shù)量有限,該現(xiàn)象還需要進一步擴大隨訪例數(shù)進行驗證。細胞角蛋白19 (cytokeratin 19,CK19)是膽管細胞和肝祖細胞的標志物,與肝癌患者的預后不良密切相關(guān)[10-11]。近期研究發(fā)現(xiàn),CK19的表達與上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)的表達相比,與腫瘤侵襲更具有相關(guān)性[12]。CTC CK染色增強可能強烈提示預后不良,其預后價值不亞于CTC數(shù)量。凋亡CTC的出現(xiàn)提示CTC即將被清除[4],在我們的研究中多見于肝移植術(shù)后患者,即使CTC數(shù)量未下降,凋亡CTC的出現(xiàn)也提示預后良好。

我們通過Kaplan-Meier生存分析,比較不同亞組CTC患者無進展生存率,CTC體積穩(wěn)定組、CK染色增強組、無CTC凋亡組的無進展生存率均顯著低于CTC體積變化組、無CK染色增強組、CTC凋亡組。進一步驗證了以CTC形態(tài)特征為基礎(chǔ)的CTC亞組(包括CTC體積變化、CK染色增強、CTC凋亡)可能與肝癌患者的臨床預后相關(guān)。有效的治療不僅使CTC數(shù)量下降,也可能使CTC形態(tài)發(fā)生一定的改變。我們報告CTC數(shù)量的同時,若能兼顧CTC形態(tài)的變化,可以給臨床提供更多監(jiān)測數(shù)據(jù),有助于臨床醫(yī)師更準確地判斷治療效果并及時調(diào)整治療方案,以期改善預后。同時,CTC形態(tài)特征變化對臨床預后可能有一定的提示作用。當然,局限于本文連續(xù)監(jiān)測CTC且能觀察到CTC形態(tài)變化的患者例數(shù)有限,還需要進一步擴大數(shù)據(jù),進行驗證。