扶澤南，楊龍，夏桂玲，何炯紅，黃勇淇，田野

(1貴州省人民醫(yī)院·貴州醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院，貴陽550002)

心肌異常肥大導致的心室重構是慢性充血性心力衰竭(CHF)最主要的發(fā)生機制[1]。CHF患者最主要的死亡原因為心臟性猝死(SCD)[2]。心室肌細胞離子通道重構是導致細胞動作電位時程(APD)改變，進而引發(fā)惡性室性心律失常的重要病理生理基礎[3,4]。內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)參與動作電位復極后期進程，具有穩(wěn)定心肌細胞靜息電位、保障心臟復極儲備的作用。研究[5,6]發(fā)現(xiàn)，編碼Ik1離子通道α亞基的Kir2.1基因突變可導致長、短QT綜合征。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)是迄今所知的惟一一種受Ca2+/鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，廣泛分布于機體各種組織中,參與多種信號轉(zhuǎn)導通路,并通過作用于不同的底物而產(chǎn)生不同的生物學效應。CaN的活化可促進心肌肥厚性重構和心力衰竭，導致心律失常性死亡[7]；CaN的活性改變影響肥大心肌細胞離子通道的重構[8～10]。目前關于鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶Aβ亞基(CnAβ)在CHF中的具體作用機制相關研究報道較少。2016年11月～2017年12月，我們觀察了CnAβ基因沉默的乳鼠肥大心室肌細胞Ik1及動作電位的變化，旨在為CnAβ在CHF發(fā)生、發(fā)展中的作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、儀器與試劑 清潔級1 d齡SD乳鼠60只，雌雄不限，由北京大學醫(yī)學部動物中心提供，許可證號[SYXK(京)2011-0039]。膜片鉗放大器及數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器(美國Axon公司)，兔抗大鼠CnAβ抗體(德國Merck Millipore公司)，Ⅱ型膠原酶和胰酶(美國Sigma公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基、特優(yōu)級胎牛血清(FBS)、苯腎上腺素(PE)和5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)為美國Gibco公司生產(chǎn)，重組腺病毒shRNA干擾載體介導沉默編碼CnAβ的基因(Ad-CnAβshRNA1，簡寫A1，5′-CAGAAAGGGTCTATGAAGCTTGTAT-3′)及腺病毒空載體由漢恒生物科技(上海)有限公司包裝制備。

1.2 乳鼠心室肌細胞分離、培養(yǎng)及肥大刺激方法 取乳鼠，乙醚麻醉，開胸取心臟，分離心室并剪碎。酶解法分離細胞，差速貼壁結合5-BrdU培養(yǎng)獲得心室肌細胞，37 ℃ 、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，換無血清DMEM高糖培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期心室肌細胞，加入終濃度100 μM的PE刺激培養(yǎng) 48 h，RT-qPCR法測定細胞肌球蛋白重鏈β(β-MHC，上游引物序列5′-CAAGGAGCTCACCTACCAGA-3′，下游引物序列5′-CAGCTTGTTGACCTGGGACT-3′)、腦鈉尿肽(BNP，上游引物序列5′-GTCTCCAGAACAATCCACGA-3′，下游引物序列：5′-CTAAAACAACCTCAGCCCGT-3′)[10]。結果發(fā)現(xiàn)，與刺激前比較，PE刺激48 h時心室肌細胞BNP、β-MHC的mRNA相對表達量均上調(diào)，說明PE可導致心室肌細胞肥大[10]。

1.3 心室肌細胞分組及CnAβ基因沉默方法 取心室肌細胞，分為A、B、C、D組。A組加入MOI=50對應量的腺病毒空載體，感染6 h時更換成2倍體積新鮮無血清DMEM，培養(yǎng)48 h。B組加入MOI=50對應量的腺病毒空載體，感染6 h換為2倍體積新鮮無血清DMEM，感染24 h時加入終濃度為100 μmol/L 的PE，培養(yǎng)48 h。C組加入MOI=50對應量的A1，感染6 h時換成2倍體積新鮮無血清DMEM，培養(yǎng)48 h。D組加入MOI=50對應量的A1，感染6 h時換成2倍體積新鮮無血清DMEM，感染24 h時加入終濃度為100 μmol/L 的PE，培養(yǎng)48 h。

1.4 各組心室肌細胞CnAβ蛋白檢測方法 采用Western blotting法。取各組細胞檢測心肌細胞CnAβ蛋白[10]。所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。以目的條帶的灰度值代表CnAβ蛋白的相對表達量，實驗重復3次，取平均值。

1.5 各組心室肌細胞Ik1及動作電位變化觀察 采用全細胞膜片鉗實驗。取各組細胞，在電壓鉗模式下記錄各組Ik1，計算電流密度(pA/pF)=電流強度/電容。Ik1超極化階躍方案：將鉗制電壓設置為-40 mV，-140 mV～-40 mV系列脈沖刺激，躍階電壓10 mV，波寬600 ms，頻率0.1 Hz的刺激。電流鉗模式下記錄AP，給予1 nA電流脈沖，波寬2.5 ms，引發(fā)心室肌細胞AP。記錄并分析動作電位復極20%、50%和90%(APD20、APD50、APD90)。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 各組心室肌細胞CnAβ蛋白相對表達量比較 A、B、C、D組心室肌細胞CnAβ蛋白相對表達量分別為1.0±0.01、2.59±0.30、1.00±0.16、0.82±0.16，與A組比較，B組心室肌細胞CnAβ蛋白相對表達量升高(P<0.05；n=3)；與B組比較，C組心室肌細胞CnAβ蛋白相對表達量降低(P<0.05；n=3)。

2.2 各組心室肌細胞Ik1變化比較 各組心室肌細胞Ik1變化見表1，Ik1電流-電壓圖見圖1。

圖1 各組心室肌細胞Ik1電流-電壓變化

組別電流密度-140 mV-130 mV-120 mV-110 mV-100 mV-90 mVA組-28.69±2.65-22.58±2.22-18.39±2.24-14.69±1.86-11.64±2.16-7.90±1.45B組-15.2±1.38a-12.4±0.86a-10.42±0.86a-8.48±0.74a-6.83±0.62a-4.92±0.46aC組-20.7±2.37b-16.8±2.13b-14.00±1.75b-11.20±1.59b-8.79±1.27b-6.36±1.04bD組-23.31±2.54-19.06±2.16-15.88±1.81-12.79±1.51-9.99±1.36-7.13±1.02

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較,bP<0.05。

2.3 各組心室肌細胞APD20、APD50、APD90比較 各組心室肌細胞APD20、APD50、APD90比較見表2。與A組比較，B組心室肌細胞APD20、APD50、APD90均升高(P均<0.05)；與B組比較，C組B組心室肌細胞APD20、APD50、APD90均降低(P均<0.05)

表2 各組心室肌細胞APD20、APD50、APD90比較

注：與A組比較，aP<0.01；與B組比較,bP<0.01。

3 討論

病理性心肌肥大是導致CHF的主要機制。惡性室性心律失常導致的SCD是CHF最主要的死因。Ik1在復極后期和穩(wěn)定心肌細胞靜息電位發(fā)揮著重要作用。在超級化狀態(tài)下，內(nèi)向電流顯著增大；弱去極化時，電流改為外向，使膜電位保持在靜息電位水平。當Ik1受到抑制時，可使膜電位升高，動作電位時程延長。慢性的血管緊張素Ⅱ刺激心臟能使Ik1電流密度減少，從而延長APD，導致LQTs[11]。心力衰竭時心肌細胞易發(fā)生晚期后除極(DADs)和觸發(fā)活動，Ik1的下調(diào)為其主要機制之一[12]。在小鼠模型中，Kir2.1亞基過表達增加Ik1離子通道密度，保證快速和穩(wěn)定的鉀離子轉(zhuǎn)運，穩(wěn)定細胞膜電位，抑制折返性心動過速[13]。心力衰竭引發(fā)細胞水平的電生理重構，其中包括蘭尼膽堿受體(RyRs)敏感性增加，促進鈣離子釋放和抑制Ik1；增加RyRs的敏感性和減小Ik1促進室性早搏和室性心動過速的發(fā)生[14]。有研究顯示，α腎上腺素能受體激動劑甲氧胺干預能抑制兔心肌細胞的Ik1振幅[15]；PE因?qū)е翴k1減小而促進室性心律失常的發(fā)生[16]；PE刺激單個分離的大鼠心室肌細胞15 min即導致Ik1的峰值減少45.8%[17]。

CaN參與心肌細胞肥大和心肌細胞膜多種離子通道結構和功能改變的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，CaN轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生顯著的心室肥大，并進展為心室擴張和心力衰竭，給予CaN阻斷劑環(huán)孢素A(CsA)或他克莫司(FK506)干預明顯抑制該小鼠心室肥大，延緩心力衰竭的發(fā)生和減輕心力衰竭的嚴重程度[7]。給予血管緊張素II、PE或1%濃度的胎牛血清刺激培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞，導致CaN活性增加、CnAβ基因和蛋白表達上調(diào)、心肌細胞肥大；給予CaN抑制蛋白cain/cabin 1和AKAP79干預能顯著抑制該心肌細胞肥大和CnAβ基因及蛋白的表達[18]。在培養(yǎng)的乳鼠心房肌細胞，機械牽張刺激促進細胞肥大和CaNA亞基蛋白表達，抑制編碼瞬時外向鉀電流離子通道α亞基的Kv4.3蛋白表達；給予CsA干預，顯著抑制牽張刺激誘導的心房肌細胞肥大、CaNA亞基蛋白表達上調(diào)和Kv4.3蛋白表達下調(diào)[9]。在培養(yǎng)的乳鼠心室肌細胞，給予PE刺激促進細胞肥大，上調(diào)細胞CnAβ蛋白表達，下調(diào)編碼快鈉電流離子通道α單位的Nav1.5 mRNA和蛋白表達；給予Ad-CnAβshRNA1沉默CnAβ基因干預顯著抑制PE刺激的上述效應[10]。

CnAβ是CaN調(diào)控心肌肥大主要的功能結構。本研究采用CnAβ基因沉默的方法充分抑制其蛋白表達，使得CaN喪失發(fā)揮功能活性的物質(zhì)基礎，評估CaN活性充分抑制對Ik1的影響。結果顯示，與未予PE刺激的null組細胞比較，在PE刺激的肥大心室肌細胞Ik1明顯減?。欢鳤1轉(zhuǎn)染沉默CnAβ基因能夠明顯抑制PE誘導的心室肌細胞Ik1改變。

我們前期的研究結果顯示，機械牽張刺激導致乳鼠心房肌細胞肥大，促進CaN A亞基和構成Ik1離子通道的Kir2.1蛋白表達，增大Ik1電流密度；CaN阻斷劑CsA干預顯著抑制牽張刺激的上述效應[8]。并且，我們在乳鼠心室肌細胞離體實驗中發(fā)現(xiàn)，PE干預促成細胞肥大及CnAβ蛋白表達增加，調(diào)控組成鈉離子通道的Nav1.5蛋白表達[10]。本研究中，PE刺激明顯減小乳鼠心室肌細胞Ik1電流密度，延長APD20、APD50和APD90；敲低CnAβ基因顯著抑制PE刺激對Ik1電流密度和APD的影響。機械牽張刺激和PE干預皆導致心肌細胞肥大和CaN A亞基蛋白表達增加，并且針對CaN抑制性干預皆有效，而兩者Ik1電流密度的變化結果相反，原因不明。針對離體乳鼠心肌細胞Ik1的調(diào)控，不排除機械牽張刺激和PE干預存在CaN信號以外的作用機制影響干預效應，或者是因為心房肌和心室肌細胞Ik1離子通道存在差異所致。

綜上所述，CnAβ基因沉默的乳鼠肥大心室肌細胞Ik1電流密度升高，心室肌細胞APD20、APD50、APD90均降低。CnAβ可能通過調(diào)節(jié)Ik1電流密度減小、APD延長參與心室肥大的發(fā)生發(fā)展。