徐建強(qiáng)，張 勇，平忠良，孫 迪，劉鵬飛，楊 霞，李慧凱，曹 瑜 ，林曉民

(1.河南科技大學(xué)林學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471003; 2.安徽省農(nóng)科院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，安徽合肥 230031)

由禾谷鐮孢菌復(fù)合群(Fusariumgraminearumspecies complex，F(xiàn)GSC)引起的小麥赤霉病，一直是中國(guó)江淮流域、西南冬麥區(qū)及東北春麥區(qū)最主要的小麥病害之一[1]。近年來(lái)，由于全球氣候變化和耕作制度的調(diào)整，赤霉病的發(fā)生在我國(guó)有北擴(kuò)西移的趨勢(shì)，山東、河南、陜西等省麥區(qū)小麥赤霉病的流行頻率有所增加，發(fā)生程度加重[2]。赤霉菌不僅影響小麥產(chǎn)量，其在小麥中產(chǎn)生的鐮刀菌毒素還危害人畜健康[3-4]。目前，對(duì)小麥赤霉病的生物防治措施仍不完善，小麥品種赤霉病抗源匱乏，培育抗病品種困難重重[5-6]。小麥赤霉病的防治仍以化學(xué)防治為主，但是病菌已對(duì)防治赤霉病的主要藥劑—多菌靈產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，且抗藥性群體有隨著種子調(diào)運(yùn)及聯(lián)合收割機(jī)跨區(qū)作業(yè)等方式從抗藥性發(fā)生較早的江淮麥區(qū)北向山東、河南，西向湖北、四川擴(kuò)散的趨勢(shì)[7-8]。

戊唑醇為三唑類(lèi)殺菌劑，可引起小麥赤霉病菌菌絲形態(tài)和結(jié)構(gòu)的明顯畸形[9]。室內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，戊唑醇處理后小麥赤霉病菌菌絲末端分枝增多，新生菌絲伸長(zhǎng)受阻，菌絲體局部膨大，有時(shí)可見(jiàn)菌絲及芽管的消解[10]；此外，戊唑醇噴施可推遲麥穗上分生孢子的萌發(fā)，引起芽管畸形，不能形成侵染菌絲，嚴(yán)重影響病菌的侵染過(guò)程[11]。Yin等[12]、葉 滔等[13]及宋陽(yáng)陽(yáng)等[14]測(cè)定小麥赤霉病菌對(duì)戊唑醇敏感性的結(jié)果均顯示，戊唑醇對(duì)小麥赤霉病菌菌絲生長(zhǎng)有很高的抑制作用。戊唑醇不但在溫室及田間對(duì)赤霉病有較好的防效，而且還能促進(jìn)小麥增產(chǎn)[15]。目前，盡管已有河南省小麥赤霉病菌對(duì)戊唑醇敏感性的報(bào)道，但所用菌株僅為個(gè)別地區(qū)菌株，難以反映河南省的總體情況；而同一省份不同地市菌株對(duì)同一藥劑的敏感性存在著很大差異[16]。目前，尚未有河南省小麥赤霉病菌群體對(duì)戊唑醇敏感性的系統(tǒng)報(bào)道。為明確當(dāng)前河南省小麥主產(chǎn)區(qū)赤霉病菌對(duì)戊唑醇的敏感性現(xiàn)狀，本研究采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了2016年從河南省11個(gè)地市分離的小麥赤霉病菌對(duì)戊唑醇的敏感性，建立敏感基線，分析不同地區(qū)菌株的敏感性差異，以期為戊唑醇在河南省小麥赤霉病防治中的合理利用提供依據(jù)，為病原菌對(duì)藥劑的敏感性監(jiān)測(cè)提供信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2016年4-5月從河南省各地市大面積種植小麥的鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集染病麥穗，帶回實(shí)驗(yàn)室后采用組織分離法，從小麥穗軸病健交界處分離赤霉病菌；如果麥穗上有粉紅色霉層或籽粒變癟，也可以從染病麥粒上直接分離；待長(zhǎng)出生長(zhǎng)一致的菌落后，轉(zhuǎn)入3%綠豆湯培養(yǎng)液里搖培，5 d后挑單孢，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定共獲得小麥赤霉病菌單孢分離菌株 113株(表1)。

1.2 供試藥劑

98%戊唑醇(tebuconazole)原藥，廣西田園生化股份有限公司生產(chǎn)；97.9%的咯菌腈(fludioxonil)原藥，先正達(dá)(中國(guó))投資有限公司生產(chǎn)；98%多菌靈(Carbendazim)原藥，山東省雙星農(nóng)藥廠生產(chǎn)。多菌靈原藥預(yù)溶于0.1 mol·L-1稀鹽酸中，戊唑醇和咯菌腈原藥預(yù)溶于甲醇中，均配制成1.0×104μg·mL-1的母液，放于4℃冰箱中備用。

表1 供試菌株采集信息Table 1 Tested isolates in the study

1.3 戊唑醇對(duì)小麥赤霉病菌的最低抑制濃度測(cè)定

隨機(jī)選取LYMJ-1、LYMJ-2、SQSY-1及LHLY-4四個(gè)菌株，進(jìn)行戊唑醇對(duì)赤霉病菌最低抑制濃度(minimum inhibition concentration,MIC)測(cè)定，采用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行[17]。將供試菌株在PSA平板上25 ℃培養(yǎng)3 d后，用打孔器在菌落邊緣制成直徑5 mm的菌餅，菌絲面朝下接入含0.5、1.0、2.0及4.0 μg·mL-1戊唑醇的PSA平板上，以不含藥劑的平板作對(duì)照[17]；每處理3次重復(fù)，于25℃下黑暗倒置培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算各濃度藥劑的菌絲生長(zhǎng)抑制率。以全部供試菌株菌絲生長(zhǎng)受到抑制的最小濃度作為戊唑醇對(duì)小麥赤霉病菌的最低抑制濃度。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照菌落直徑平均值-處理菌落直徑平均值)/(對(duì)照菌落直徑平均值-菌餅直徑)×100%

1.4 小麥赤霉病菌對(duì)戊唑醇的敏感性測(cè)定

試驗(yàn)方法同1.3，戊唑醇濃度設(shè)置為0.031 25、0.062 5、0.125、0.250、0.50及1.0 μg·mL-1，培養(yǎng)3 d后計(jì)算各濃度下的菌絲生長(zhǎng)抑制率，利用EXCEL 2007和DPS 6.55軟件插件中的“數(shù)量型數(shù)據(jù)機(jī)值分析”計(jì)算藥劑抑制菌絲生長(zhǎng)的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)R和有效中濃度(EC50)。

1.5 敏感性分布圖繪制及敏感性基線的確定

參照徐建強(qiáng)等[18]的方法，將病菌群體對(duì)供試藥劑的敏感性從低到高分成幾個(gè)區(qū)間，統(tǒng)計(jì)每個(gè)區(qū)間的菌株數(shù)和頻率，以每個(gè)區(qū)間的EC50中值為橫坐標(biāo)，菌株頻率為縱坐標(biāo)，制作病菌對(duì)戊唑醇的敏感性頻率分布圖。對(duì)所有EC50值利用DPS 6.55軟件進(jìn)行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)[16]。

1.6 不同地區(qū)菌株對(duì)戊唑醇敏感性差異的分析

采用最小顯著差異法(least significant difference,LSD)對(duì)戊唑醇對(duì)各縣市菌株的毒力進(jìn)行單因素差異顯著性分析[16]；每地隨機(jī)選擇3株，共33株病菌(表1)，采用SPSS 20.0對(duì)戊唑醇抑制病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50值進(jìn)行聚類(lèi)分析[19]。

1.7 小麥赤霉病菌對(duì)戊唑醇和對(duì)多菌靈、咯菌腈敏感性的相關(guān)性分析

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[19]。從分離菌中選取對(duì)戊唑醇敏感性不同的菌株，測(cè)定其對(duì)咯菌腈的敏感性，濃度設(shè)置為0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.10和0.20 μg·mL-1；測(cè)定其對(duì)多菌靈的敏感性，濃度設(shè)置為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.8 μg·mL-1。試驗(yàn)及數(shù)據(jù)處理方法同1.3及1.4。參照李波濤等[20]的方法判斷病菌對(duì)戊唑醇和對(duì)多菌靈、咯菌睛敏感性的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 戊唑醇對(duì)小麥赤霉病菌菌絲生長(zhǎng)的MIC

由圖1可知，0.5 μg·mL-1戊唑醇對(duì)四株病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率已在85%以上；隨著戊唑醇濃度的升高，菌絲生長(zhǎng)抑制率逐漸增大；戊唑醇濃度達(dá)到4.0 μg·mL-1時(shí)，四個(gè)菌株則全部不生長(zhǎng)。由此可知，戊唑醇對(duì)赤霉病菌菌絲生長(zhǎng)的最低抑制濃度為4.0 μg·mL-1。不同菌株對(duì)戊唑醇的敏感性不同。

圖1 戊唑醇對(duì)小麥赤霉病菌菌絲生長(zhǎng)的MICFig.1 MIC of tebuconazole to mycelial growth of Fusarium graminearum

2.2 小麥赤霉病菌對(duì)戊唑醇的敏感性及敏感基線

供試113株病菌對(duì)戊唑醇的敏感性基本呈連續(xù)性分布，EC50的變化范圍為0.010～0.237 μg·mL-1，最大值為最小值的24.19倍；平均EC50值為0.057±0.041 μg·mL-1(圖2A，表2)。Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，供試菌株對(duì)戊唑醇的敏感性頻率不符合正態(tài)分布(W=0.779，P<0.05)，但有 81.4% 的菌株(92株)集中位于圖2B中相應(yīng)的主峰范圍內(nèi)，呈近似正態(tài)分布(W=0.974，P=0.067>0.05)，其敏感性頻率分布為連續(xù)單峰曲線，因此將其EC50平均值0.041±0.016 μg·mL-1作為小麥赤霉病菌對(duì)戊

唑醇的敏感性基線。

2.3 不同地區(qū)小麥赤霉病菌對(duì)戊唑醇的敏感性

由表2可知，同一縣市菌株對(duì)戊唑醇的敏感性差異較大，洛陽(yáng)市洛龍區(qū)菌株差異最大，EC50最大值和最小值比達(dá)到14.40；其次為漯河臨潁，二者比值達(dá)到12.60；而鄭州鞏義菌株間敏感性差異最小(1.10)；其余大部分地區(qū)菌株EC50最大與最小比值為1.32～7.65。

除周口沈丘及洛陽(yáng)孟津菌株外，其余9個(gè)縣市間菌株對(duì)戊唑醇的敏感性差異不顯著。戊唑醇的平均EC50值變化范圍為0.038～0.101 μg·mL-1，其中，洛陽(yáng)孟津菌株最為敏感，而周口沈丘菌株最不敏感，兩地菌株EC50平均值比值為2.66。各地區(qū)菌株的平均EC50值比較，洛陽(yáng)孟津、商丘睢陽(yáng)、信陽(yáng)平橋、駐馬店泌陽(yáng)、鄭州鞏義五地菌株對(duì)戊唑醇的敏感性高于河南省平均水平；其他地區(qū)菌株對(duì)戊唑醇的敏感性低于河南省平均水平。

2.4 不同地區(qū)菌株對(duì)戊唑醇敏感性水平的系統(tǒng)聚類(lèi)分析

根據(jù)33個(gè)小麥赤霉病菌菌株的EC50值，可將其分為5類(lèi)(圖3)，所包括的菌株數(shù)分別為18、3、2、8及2個(gè)。除鄭州鞏義、洛陽(yáng)孟津及商丘睢陽(yáng)的菌株全部聚在第Ⅰ類(lèi)外，其余縣市的菌株均出現(xiàn)在不同的類(lèi)中，說(shuō)明同一縣市的菌株對(duì)戊唑醇敏感性差異較大，而不同縣市菌株對(duì)戊唑醇敏感性差異不明顯，這與LSD法的分析結(jié)果一致，說(shuō)明小麥赤霉病菌對(duì)戊唑醇的敏感性差異與菌株來(lái)源無(wú)明顯相關(guān)性。

圖2 小麥赤霉病菌對(duì)戊唑醇的敏感性(A)及頻率分布(B)Fig.2 Sensitivity(A) and frequency(B) of Fusarium graminearum to tebuconazole表2 河南省不同地區(qū)小麥赤霉病菌對(duì)戊唑醇的敏感性Table 2 Sensitivity of Fusaium graminearum to tebuconazole from different areas in Henan Province

采集地點(diǎn)Sampling siteEC50范圍Range/(μg·mL-1)EC50(Max.)/EC50(Min.)均值±標(biāo)準(zhǔn)差Mean±SD/(μg·mL-1)敏感性指數(shù)Toxicity index漯河臨潁 Linying County,Luohe0.010～0.12612.600.055±0.037abc0.96洛陽(yáng)洛龍 Luolong District,Luoyang 0.015～0.21614.400.065±0.048ab1.14洛陽(yáng)孟津 Mengjin County,Luoyang 0.031～0.0451.450.038±0.006c0.67南陽(yáng)方城 Fangcheng County,Nanyang 0.034～0.0902.650.060±0.028abc1.05平頂山葉縣 Ye County,Pingdingshan 0.045～0.0791.760.059±0.015abc1.04商丘睢陽(yáng) Suiyang District,Shangqiu 0.037～0.0491.320.041±0.005bc0.72新鄉(xiāng)延津 Yanjin County,Xinxiang 0.041～0.0741.800.052±0.019abc0.91信陽(yáng)平橋 Pingqiao District,Xinyang 0.020～0.0673.350.040±0.015bc0.70周口沈丘 Shenqiu County,Zhoukou 0.031～0.2377.650.101±0.068a1.77駐馬店泌陽(yáng) Biyang County,Zhumadian 0.013～0.0705.380.042±0.017bc0.74鄭州鞏義 Gongyi City,Zhengzhou 0.039～0.0431.100.041±0.002bc0.72總計(jì) Total0.010～0.23723.700.057±0.041abc1.00

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示在0.05水平差異顯著。

Different letters following data in same column indicate significant difference at 0.05 level.

圖3 不同地理來(lái)源菌株對(duì)戊唑醇敏感性水平的系統(tǒng)聚類(lèi)分析Fig.3 Hierarchical cluster analysis on EC50 values of tebuconazole to Fusarium graminearum

2.5 小麥赤霉病菌的戊唑醇、咯菌腈、多菌靈敏感性相關(guān)性分析

戊唑醇對(duì)77株(隨機(jī)選取，對(duì)戊唑醇抗性不同)小麥赤霉病菌的EC50均值為0.059±0.041 μg·mL-1，咯菌腈對(duì)77株小麥赤霉病菌的EC50均值為0.010±0.011 μg·mL-1，二者的EC50值線性回歸方程為y=0.123x+0.003，b為正值，P<0.05，差異顯著；但決定系數(shù)(R2)為0.212，小于0.8，說(shuō)明小麥赤霉病病菌對(duì)戊唑醇與咯菌腈的敏感性間無(wú)相關(guān)性。

戊唑醇對(duì)67株(隨機(jī)選取，對(duì)戊唑醇抗性不同)小麥赤霉病菌的EC50均值為0.066±0.046 μg·mL-1，多菌靈對(duì)67株小麥赤霉病菌的EC50均值為0.403±0.119 μg·mL-1，二者的EC50值線性回歸方程為y=-0.240x+0.418，b為負(fù)值，P<0.05，差異顯著；但決定系數(shù)(R2)為0.008，小于0.8，說(shuō)明病菌對(duì)戊唑醇與多菌靈的敏感性間無(wú)相關(guān)性。

圖4 小麥赤霉病菌對(duì)戊唑醇與其對(duì)咯菌腈、多菌靈敏感性之間的相關(guān)性Fig.4 Correlation of the susceptibility of Fusarium graminearum between tebuconazole and fludioxonil,or carbendazim

3 討 論

Yin等[12]測(cè)定了40株禾谷鐮孢菌及116株亞洲鐮孢菌對(duì)戊唑醇的敏感性，基線分別為0.248和0.316 μg·mL-1。葉 滔等[13]測(cè)定了采自河南、山東、河北三省的120株病菌對(duì)戊唑醇的敏感性，建立的敏感性基線為0.103 μg·mL-1。宋陽(yáng)陽(yáng)等[14]測(cè)定了采自湖北省的100株病菌對(duì)戊唑醇的敏感性，敏感性基線為0.181 μg·mL-1。本研究中，小麥赤霉病菌對(duì)戊唑醇的敏感性基線為0.041 μg·mL-1，小于以上結(jié)果。這可能是由于菌株地理來(lái)源、供試菌株數(shù)目、用藥時(shí)間長(zhǎng)短不同造成的。Yin等[12]所測(cè)得的敏感性基線值最高，這可能是由于其所用菌株多采自江蘇、浙江地區(qū)，小麥赤霉病在這些地區(qū)發(fā)生時(shí)間長(zhǎng)，發(fā)病重，菌源數(shù)量大，用藥時(shí)間長(zhǎng)，用藥水平較高，從而導(dǎo)致病菌對(duì)藥劑的敏感性有所降低。

葉 滔等[21]通過(guò)紫外誘變獲得了小麥赤霉病菌對(duì)戊唑醇的抗藥性菌株，表明病菌對(duì)戊唑醇可能具有抗性風(fēng)險(xiǎn)，但突變體獲得抗藥性的同時(shí)伴隨著生長(zhǎng)繁殖能力的下降；戊唑醇與苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、異菌脲、百菌清和福美雙均無(wú)交互抗性。本研究結(jié)果表明，小麥赤霉病菌對(duì)戊唑醇與其對(duì)多菌靈、咯菌腈的敏感性間無(wú)相關(guān)性。這為進(jìn)行戊唑醇和其他藥劑的復(fù)配來(lái)對(duì)小麥赤霉病實(shí)施化學(xué)防治提供了參考。

當(dāng)前河南省小麥赤霉病菌對(duì)戊唑醇的敏感性不符合正態(tài)分布，已出現(xiàn)了敏感性下降的亞群體，但菌株數(shù)量較少，所占頻率較低，這說(shuō)明河南省小麥生產(chǎn)中仍然可使用戊唑醇進(jìn)行小麥赤霉病的化學(xué)防治，也可以通過(guò)同其他藥劑復(fù)配來(lái)延緩抗性的發(fā)展。但為了追蹤病菌對(duì)藥劑的敏感性變化情況，生產(chǎn)中應(yīng)持續(xù)監(jiān)測(cè)小麥赤霉病菌對(duì)戊唑醇的敏感性。