李梓彰，丁 寧，田 文，鄭文杰，張 珊，聞珊珊

(西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院，陜西楊凌 712100)

真核生物的遺傳信息主要儲存在染色質內，而染色質的基本組成單位是核小體。核小體由核心組蛋白組成的八聚體和纏繞其上的一段約147 bp的雙鏈DNA組成[1]，其中核心組蛋白對于調控核小體和染色質結構具有重要意義。組蛋白乙?；揎検呛诵慕M蛋白上的一種重要的修飾作用，它可以使核小體構象發(fā)生有利于轉錄調節(jié)蛋白和染色質相結合的改變，從而提高基因轉錄活性[2]。組蛋白的乙?；强赡娴?，由組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferases,HAT)和組蛋白去乙?；?histone deacetylase,HDAC)共同調節(jié)[3-4]。HDAC負責去除組蛋白上的乙?；鶊F，使染色質結構變得緊密，抑制基因的表達。HDAC廣泛存在于動植物和真菌中，主要分為三個家族，分別是Rpd3家族、Sir2家族和HD2家族[5-7]。

HD2家族是植物特有的組蛋白去乙?；讣易錥8]，在序列上與其他HDAC家族完全不同。其蛋白質序列在N端通常包含一段保守的氨基酸序列(MEFWG)，被稱為 HD2基因標簽( HD2s label)，是HD2家族最明顯的特征[9]。此外，HD2家族內部成員之間，最大的不同是其C端是否含有鋅指結構，根據(jù)這一特征可將其分為Group1和Group2[8]。

HD2基因首次從玉米中被鑒定和克隆出來[10-11]，研究表明， HD2基因參與核糖體染色質結構調節(jié)和功能調控[12]。隨后，在模式植物擬南芥中鑒定到4個HD2家族成員，分別為 HD2A、 HD2B、 HD2C及 HD2D[5,13-14]。對其進一步研究表明，4個基因中， HD2A、 HD2B和 HD2C在植物受精、種子發(fā)育和葉發(fā)育過程中具有重要作用[15]。如 HD2A基因的缺失會影響種子和葉的發(fā)育，導致種子畸形，果實干癟[16]； HD2B基因可被低溫和種子休眠誘導表達[17]； HD2D則在擬南芥根部發(fā)育中具有重要作用。 HD2基因不僅參與植物生長發(fā)育過程，且在植物多種非生物脅迫響應中發(fā)揮重要作用。在擬南芥中的研究表明，過表達 HD2D會提高植物對干旱脅迫、鹽脅迫和ABA脅迫的抵抗能力[18]。同時，HD2家族去乙?；高€可以與其他去乙酰化酶相互作用，共同調控植物對脅迫的響應。如，HD2C可以與HDA6和RPD3家族去乙?；腹餐饔糜诮M蛋白H3上，從而參與調節(jié)植物ABA和鹽脅迫的響應[19-20]。 HD2C也可以與染色質重組復合物相互作用，調節(jié)植物熱脅迫響應[21]。

近年來，氣候變化對小麥的產(chǎn)量產(chǎn)生了重大影響，各種不利于小麥的環(huán)境因素威脅著小麥的生長[22]。目前，關于 HD2基因的研究已在擬南芥和玉米等植物中報道，但關于小麥 HD2基因還鮮有研究。本研究利用生物信息學方法對小麥 HD2基因進行全基因組鑒定、互作網(wǎng)絡和不同組織及逆境脅迫下的表達模式等進行系統(tǒng)分析；并選用科農(nóng)199(Kenong 199)半冬性小麥品種，利用qRT-PCR方法研究 HD2基因在小麥生長發(fā)育的不同時期葉片組織響應熱脅迫的表達模式，為進一步研究小麥 HD2基因的功能機制和改良小麥性狀提供參考。

1 材料與方法

用田 文等[23]在“普通小麥DREB基因家族的全基因組鑒定及熱脅迫下的表達模式分析”一文中所采用的方法對 HD2基因做如下研究：(1)基因家族成員的全基因組鑒定；(2)序列多重比對和進化樹構建；(3)基因結構和蛋白質保守結構域分析；(4)染色體定位、順式作用元件及互作網(wǎng)絡分析；(5)不同組織和不同逆境下的表達模式分析；(6)小麥品種科農(nóng)199植株的干旱和熱脅迫處理，以及處理植株RNA提取、cDNA合成和qRT-PCR分析。qRT-PCR分析中所用的特異性引物見表1。

2 結果與分析

2.1 小麥 HD2基因家族成員鑒定

利用HMMER建模搜索和BLASTP比對搜索兩種方法，從小麥基因組中共鑒定出39個 HD2候選基因，進一步去除冗余、根據(jù)保守結構域和基因結構驗證篩選，最終得到12個小麥 HD2基因，根據(jù)其蛋白質C端是否含有鋅指結構和在染色體上的位置，將其命名。所有的小麥HD2蛋白的N端均含有保守的MEFWG或MSSFWG序列，這是已報道的 HD2基因標簽(gene label)。在鑒定到的12個小麥 HD2基因中，有7個基因的編碼蛋白序列的C端含有鋅指結構，它們屬于Group1；有5個基因的編碼蛋白序列的C端沒有鋅指結構，屬于Group2。小麥 HD2基因編碼蛋白的序列長度為312～472個氨基酸，分子量為3.37～5.17 kDa，理論等電點為4.60～8.78。亞細胞定位預測結果表明，所有的小麥HD2蛋白都定位于細胞核中。

表1 小麥 HD2基因qRT-PCR引物Table 1 Primers for qRT-PCR analysis of wheat HD2 genes

2.2 小麥 HD2基因系統(tǒng)進化、保守結構域和基因結構分析

為了分析小麥 HD2基因編碼蛋白的結構和進化關系，利用ClustalX軟件將小麥HD2蛋白和擬南芥、玉米、大麥和水稻中的HD2蛋白質序列作多重比對(圖1A)。所有的小麥HD2蛋白質序列與其他物種蛋白質序列有34.29%的相似度，它們均在N端含有已報道的 HD2基因標簽(MEFWG或MSSFWG)和兩個保守的氨基酸殘基，分別是位于25位的組氨酸殘基和位于72位的天冬氨酸殘基。其中TaHD2-G1-1B，TaHD2-G1-1A和TaHD2-G1-1D與HvHDAC2-1親緣關系更近，其蛋白質序列相似度達到53.99%；TaHD2-G1-3A，TaHD2-G1-3B1和TaHD2-G1-3D1與HvHDAC2-2親緣關系更近；TaHD2-G1-3B1，TaHD2-G1-3D和TaHD2-G1-3A與ZmHDA106親緣關系更近，其蛋白質序列相似度達到41.70%；而TaHD2-G2-2A,TaHD2-G2-5A,TaHD2-G2-5B和TaHD2-G2-5D則與AtHD2d親緣關系更近，蛋白質序列相似度達到50.86%。以上結果表明，小麥中的Group1類型 HD2基因與同是禾本科的玉米和大麥比較相似，而Group2類型 HD2基因則與擬南芥中同屬于Group2類型 HD2基因的 AtHD2d相似。

用MEME對小麥HD2和其他植物的HD2蛋白序列的保守結構域進行分析。結果(圖1B)表明，所有鑒定到的小麥HD2和其他植物HD2均含有motif 2，這是HD2的gene label；TaHD2-G2-2A和AtHD2d結構非常相似，只含有motif 2、motif 4和motif 8這三個motif；并且，TaHD2-G2-2A與同為Group2類型的HD2其他成員的結構不同，說明其可能在功能上與Group2類型的HD2其他成員存在差異。

根據(jù)Ensembl Plants上的小麥 HD2基因注釋信息，研究其內含子-外顯子分布。結果表明，在同一染色體組的小麥 HD2基因中，其外顯子-內含子結構非常相似，而在不同染色體組中則有差異。如：位于5號染色體上的 TaHD2基因，其外顯子-內含子分布非常相似，他們都含有9個內含子，且其長度和分布非常相似。同樣的情況發(fā)生在1號染色體組和3號染色體組的 TaHD2-G1-3A、 TaHD2-G1-3B1和 TaHD2-G1-3D1上。 TaHD2-G2-2A與其他 TaHD2基因的結構都不相同； TaHD2-G1-3B2和 TaHD2-G2-3D2位于進化樹上的同一分支，且它們的外顯子-內含子結構非常相似，但它們并不屬于同一種類型的 HD2基因。以上結果表明，小麥 HD2基因在同一染色體組和屬于同一類型 HD2時，其染色體結構非常相似。

Ta：Triticum aestivum；Zm：Zea mays；Hv：Hordeum vulgare；Os：Oryza sativa；At：Arabidopsis thaliana 圖1 小麥、擬南芥、玉米、水稻和大麥HD2蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹(A)及蛋白質保守結構域(B)分析Fig.1 Phylogenetic and protein conserved domain analysis of HD2 in wheat,Arabidopsis,maize,rice,and barley

表2 小麥 HD2基因在染色體上的定位Table 2 Chromosome location of HD2 genes in wheat

2.3 小麥 HD2基因染色體定位、順式作用元件及互作調控網(wǎng)絡分析

根據(jù)基因組的注釋信息，進行小麥 TaHD2基因的染色體定位；結果(表2)表明，所有鑒定到的12個小麥 HD2基因分布于小麥4個不同的染色體上，且這些基因在染色體上的分布并不均勻。1號染色體組和5號染色體組上A、B和D染色體均有一個基因；3號染色體組上含有5個基因；2號染色體組上只有一個基因。這表明，在小麥基因組中，位于3號染色體組上的 HD2基因可能發(fā)生了復制，產(chǎn)生多個拷貝，而位于2號染色體組上的 HD2基因可能發(fā)生缺失。

根據(jù)小麥與擬南芥中 HD2的同源基因，參考擬南芥基因互作網(wǎng)絡研究小麥 HD2基因與其他基因的互作調控網(wǎng)絡。結果(圖2)發(fā)現(xiàn)，只有一個小麥 HD2基因與其他小麥基因存在互作關系，形成121個分支。這些互作基因主要參與DNA和RNA的修飾，表明小麥 HD2基因主要通過DNA修飾或RNA修飾來調控基因的表達。

為進一步研究小麥 HD2基因可能的生物學功能和參與的調控網(wǎng)絡，選取所有鑒定到的小麥 HD2基因上游1.5 kb區(qū)域，用于順式作用元件的鑒定。結果表明，小麥 HD2基因上游序列中存在78個與脅迫及激素相關的順式作用元件，其中數(shù)量最多的是光響應元件，表明小麥 HD2基因可能參與光合作用過程。所有的小麥 HD2基因上游區(qū)域均含有Skn-1模體，該元件在胚乳相關基因表達中起重要作用，表明小麥 HD2基因可能參與調控胚乳的生長發(fā)育。另外，小麥 HD2基因的順式作用元件中還包含了多種非生物脅迫響應相關的調控元件，包括干旱脅迫響應元件MBS、熱脅迫響應元件HSE、低溫脅迫響應元件LTR和脫落酸脅迫響應元件motif IIb等，表明小麥 HD2基因可能參與調控多種非生物脅迫響應過程。

圖2 基于擬南芥同源基因構建的 HD2基因互作網(wǎng)絡Fig.2 Interaction network of HD2 genes in wheat according to the orthologs in Arabidopsis

2.4 小麥 HD2基因在不同組織中和不同逆境脅迫下的表達模式分析

為了解小麥 HD2基因在不同組織中的表達模式，本研究從WheatExp獲取小麥 HD2基因在根、莖、葉、穗和種子中的表達量，然后利用Heml軟件將結果可視化(圖3A)。結果表明，除 TaHD2-G1-3B2外， TaHD2基因在所有組織中都有表達，且同一基因在不同組織、不同基因在同一組織下均存在顯著差異(P<0.05)。 TaHD2-G1-1A、 TaHD2-G1-1B和 TaHD2-G1-1D在除grain z85和root z10外的所有組織中的表達量均比其他 TaHD2基因高，且其表達模式相似，表明這三個基因在小麥整個生長發(fā)育過程中都較為重要。而 TaHD2-G1-3B2在所有組織中的表達量均非常低，在種子中甚至無表達，表明該基因可能不參與種子的生長發(fā)育過程，這與擬南芥中 AtHD2d基因的表達模式相似，兩者可能具有相似的生物學功能。從整體上看，定位于同一染色體組上的小麥 HD2基因具有相似的表達模式。而對于 TaHD2-G1-3B2基因，其表達模式與其他位于3號染色體組上的小麥 HD2基因差異較大，表明其可能在小麥進化過程中，由于染色體加倍或復制等原因，功能丟失或產(chǎn)生了新的功能。

為了解小麥 HD2基因在非生物脅迫下的表達模式，本研究對從SRA數(shù)據(jù)庫下載的RNA-seq數(shù)據(jù)進行處理，得到小麥在干旱脅迫、熱脅迫和旱熱共脅迫分別處理1和6 h的表達量，并使用Heml軟件將結果可視化(圖3B)。結果表明，隨干旱脅迫時間的延長， TaHD2-G1-1A、 TaHD2-G1-1D和 TaHD2-G1-3B1的表達量呈上升趨勢； TaHD2-G2-2A在熱脅迫1 h和旱熱共脅迫1 h的表達量比對照高10倍以上。其他基因的表達量無顯著變化。由此推測，這4個基因可能在小麥響應熱脅迫和干旱脅迫的過程中發(fā)揮重要作用。

z10：第一片葉抽出胚芽鞘時期；Z13：3葉期；z23：3個分蘗時期；z30：穗長為1 cm時期；z32：2個節(jié)時期；z39：減數(shù)分裂時期；z65：開花期；z71：開花后2天；z75：開花后14天；z85：開花后30天。

z10:First leaf through coleoptile; Z13:Three leaves stage; z23:Three tillers stage; z30:Spike of 1 cm stage； z32：Two nodesstage;z39:Meiosis; z65:Anthesis; z71:2 days after anthesis; z75:14 days after anthesis;z85:30 days after anthesis.

圖3小麥HD2基因在不同組織中(A)和不同逆境下(B)的表達模式

Fig.3ExpressionprofilesofHD2genesindifferenttissuesandunderdifferentstresses

2.5 小麥 HD2基因在不同生長發(fā)育時期熱脅迫下葉片中的表達模式

為研究 HD2基因在小麥不同生長發(fā)育時期的葉片響應熱脅迫的表達模式，選取出芽3天、出芽7天、分蘗、春化、起身、拔節(jié)、挑旗、抽穗、開花、灌漿早期、灌漿晚期和成熟期共12個時期的小麥(品種為農(nóng)科199)葉片，分別在35 ℃和42 ℃下進行短期(1 h)熱脅迫處理，分析其表達量。從轉錄組數(shù)據(jù)分析和網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫中得到的表達量可以看出， TaHD2-G1-3B2和 TaHD2-G2-3D2在葉片中的表達量很低，幾乎為零，所以選取除這兩個基因以外的10個 TaHD2基因，設計引物進行qRT-PCR。結果(圖4)表明，多數(shù)基因在挑旗期和抽穗期熱脅迫下表達量明顯上升，且 TaHD2-G1-1A基因上升得最明顯，表明多數(shù) TaHD2基因可能在小麥生長發(fā)育的挑旗期和抽穗期對熱脅迫響應具有重要作用。而少數(shù)基因，如 TaHD2-G2-5B僅在起身和挑旗期表達量明顯上升，其他時期熱脅迫下表達量均下降，說明個別基因可能在別的時期熱脅迫下發(fā)揮重要作用。同時，與RNA-seq數(shù)據(jù)分析結果比較發(fā)現(xiàn)，部分基因，如 TaHD2-G1-3D1，在RNA-seq數(shù)據(jù)中熱脅迫下表達量下調，而在qRT-PCR結果中則在某些時期顯著上調，這是因為RNA-seq數(shù)據(jù)檢測的是小麥幼苗時期熱脅迫下表達量，與qRT-PCR結果相比，小麥生長發(fā)育早期熱脅迫下該基因表達也為下調，隨著小麥生長發(fā)育的進行，該基因在熱脅迫下逐漸呈現(xiàn)出不同的表達模式，說明小麥 HD2基因對熱脅迫的響應在不同時期具有不同的表現(xiàn)。

3 討 論

本研究是利用生物信息學方法第一次系統(tǒng)研究小麥中的 HD2基因，共鑒定到12個 HD2基因，相比于目前擬南芥(4個)、水稻(2個)、玉米(4個)和大麥(2個)中 HD2基因個數(shù)較多，這可能與其基因組較為龐大有關[24]，依據(jù)其蛋白肽鏈C端是否具有鋅指結構將其分為兩組[8]。蛋白質結構研究表明，這12個基因均具有 HD2基因的典型結構。進化分析結果表明，小麥中的Group 1類型 HD2基因與同是禾本科的玉米和大麥比較相似，而Group 2類型 HD2基因則與擬南芥中同屬于Group 2類型 HD2基因的 AtHD2d相似。說明小麥中Group 1和Group 2類型的 HD2基因其進化方面可能有較大區(qū)別。共表達網(wǎng)絡分析結果表明，小麥 HD2基因可能參與了小麥中DNA和RNA修飾過程。通過研究這些基因的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)其上游包含多種脅迫響應相關的元件，表明小麥 HD2基因可能在小麥多種脅迫響應中具有重要作用。在擬南芥中的研究表明， HD2基因可以與染色質重構復合物或其他基因互作，參與逆境脅迫響應過程[19-21]。結合共表達網(wǎng)絡分析結果，推測在逆境脅迫中，小麥 HD2基因也可能通過與其他基因互作，參與小麥DNA或RNA修飾，進而參與逆境脅迫響應過程。本研究利用RNA-seq數(shù)據(jù)，研究了小麥 HD2基因在不同組織下的表達模式，發(fā)現(xiàn)位于同一染色體組上的小麥 HD2基因具有相似的表達模式，特別的 TaHD2-G1-3B2表達模式與其他位于3號染色體組上的基因不同，可能的原因是在進化過程中，其功能丟失或產(chǎn)生了新的功能。

X軸上的1～12依次代表小麥出芽3天、出芽7天、分蘗期、春化期、起身期、拔節(jié)期、挑旗期、抽穗期、開花期、灌漿早期、灌漿晚期和成熟期。

1-12 on the X-axis represent the 12 growth periods of wheat including 3 days and 7 days after germination, tillering, vernalization, booting, jointing, flagging, heading, flowering, early grain filling, late filling and maturing stages of wheat,respectively.

圖4HD2基因在小麥品種科農(nóng)199不同生長發(fā)育時期的相對表達水平

Fig.4RelativeexpressionlevelsofTaHD2genesin12growthperiodsofwheat

研究表明， HD2基因在植物未成熟和成熟期對逆境脅迫的響應具有不同的表現(xiàn)，但是關于植物不同時期的具體不同表現(xiàn)目前尚不清楚[21]。熱脅迫是導致小麥產(chǎn)量和質量下降的重要因素，本研究結果表明，小麥 HD2基因在挑旗期和抽穗期熱脅迫下表達量上升明顯，其可能在這兩個時期對小麥熱脅迫響應具有重要作用。對于個別基因，如 TaHD2-G1-3A，除了在挑旗期和抽穗期外，其在拔節(jié)期、灌漿早期和成熟期熱脅迫下表達量也明顯上升，表明該基因可能在這三個時期的熱脅迫響應也有重要作用。