李梓彰，丁 寧，田 文，鄭文杰，張 珊，聞珊珊

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

真核生物的遺傳信息主要儲(chǔ)存在染色質(zhì)內(nèi)，而染色質(zhì)的基本組成單位是核小體。核小體由核心組蛋白組成的八聚體和纏繞其上的一段約147 bp的雙鏈DNA組成[1]，其中核心組蛋白對(duì)于調(diào)控核小體和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)具有重要意義。組蛋白乙?；揎検呛诵慕M蛋白上的一種重要的修飾作用，它可以使核小體構(gòu)象發(fā)生有利于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白和染色質(zhì)相結(jié)合的改變，從而提高基因轉(zhuǎn)錄活性[2]。組蛋白的乙?；强赡娴?，由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases,HAT)和組蛋白去乙?；?histone deacetylase,HDAC)共同調(diào)節(jié)[3-4]。HDAC負(fù)責(zé)去除組蛋白上的乙酰基團(tuán)，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得緊密，抑制基因的表達(dá)。HDAC廣泛存在于動(dòng)植物和真菌中，主要分為三個(gè)家族，分別是Rpd3家族、Sir2家族和HD2家族[5-7]。

HD2家族是植物特有的組蛋白去乙?；讣易錥8]，在序列上與其他HDAC家族完全不同。其蛋白質(zhì)序列在N端通常包含一段保守的氨基酸序列(MEFWG)，被稱為 HD2基因標(biāo)簽( HD2s label)，是HD2家族最明顯的特征[9]。此外，HD2家族內(nèi)部成員之間，最大的不同是其C端是否含有鋅指結(jié)構(gòu)，根據(jù)這一特征可將其分為Group1和Group2[8]。

HD2基因首次從玉米中被鑒定和克隆出來(lái)[10-11]，研究表明， HD2基因參與核糖體染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)和功能調(diào)控[12]。隨后，在模式植物擬南芥中鑒定到4個(gè)HD2家族成員，分別為 HD2A、 HD2B、 HD2C及 HD2D[5,13-14]。對(duì)其進(jìn)一步研究表明，4個(gè)基因中， HD2A、 HD2B和 HD2C在植物受精、種子發(fā)育和葉發(fā)育過(guò)程中具有重要作用[15]。如 HD2A基因的缺失會(huì)影響種子和葉的發(fā)育，導(dǎo)致種子畸形，果實(shí)干癟[16]； HD2B基因可被低溫和種子休眠誘導(dǎo)表達(dá)[17]； HD2D則在擬南芥根部發(fā)育中具有重要作用。 HD2基因不僅參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，且在植物多種非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在擬南芥中的研究表明，過(guò)表達(dá) HD2D會(huì)提高植物對(duì)干旱脅迫、鹽脅迫和ABA脅迫的抵抗能力[18]。同時(shí)，HD2家族去乙酰化酶還可以與其他去乙?；赶嗷プ饔?，共同調(diào)控植物對(duì)脅迫的響應(yīng)。如，HD2C可以與HDA6和RPD3家族去乙?；腹餐饔糜诮M蛋白H3上，從而參與調(diào)節(jié)植物ABA和鹽脅迫的響應(yīng)[19-20]。 HD2C也可以與染色質(zhì)重組復(fù)合物相互作用，調(diào)節(jié)植物熱脅迫響應(yīng)[21]。

近年來(lái)，氣候變化對(duì)小麥的產(chǎn)量產(chǎn)生了重大影響，各種不利于小麥的環(huán)境因素威脅著小麥的生長(zhǎng)[22]。目前，關(guān)于 HD2基因的研究已在擬南芥和玉米等植物中報(bào)道，但關(guān)于小麥 HD2基因還鮮有研究。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)小麥 HD2基因進(jìn)行全基因組鑒定、互作網(wǎng)絡(luò)和不同組織及逆境脅迫下的表達(dá)模式等進(jìn)行系統(tǒng)分析；并選用科農(nóng)199(Kenong 199)半冬性小麥品種，利用qRT-PCR方法研究 HD2基因在小麥生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)期葉片組織響應(yīng)熱脅迫的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究小麥 HD2基因的功能機(jī)制和改良小麥性狀提供參考。

1 材料與方法

用田 文等[23]在“普通小麥DREB基因家族的全基因組鑒定及熱脅迫下的表達(dá)模式分析”一文中所采用的方法對(duì) HD2基因做如下研究：(1)基因家族成員的全基因組鑒定；(2)序列多重比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建；(3)基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析；(4)染色體定位、順式作用元件及互作網(wǎng)絡(luò)分析；(5)不同組織和不同逆境下的表達(dá)模式分析；(6)小麥品種科農(nóng)199植株的干旱和熱脅迫處理，以及處理植株RNA提取、cDNA合成和qRT-PCR分析。qRT-PCR分析中所用的特異性引物見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥 HD2基因家族成員鑒定

利用HMMER建模搜索和BLASTP比對(duì)搜索兩種方法，從小麥基因組中共鑒定出39個(gè) HD2候選基因，進(jìn)一步去除冗余、根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)驗(yàn)證篩選，最終得到12個(gè)小麥 HD2基因，根據(jù)其蛋白質(zhì)C端是否含有鋅指結(jié)構(gòu)和在染色體上的位置，將其命名。所有的小麥HD2蛋白的N端均含有保守的MEFWG或MSSFWG序列，這是已報(bào)道的 HD2基因標(biāo)簽(gene label)。在鑒定到的12個(gè)小麥 HD2基因中，有7個(gè)基因的編碼蛋白序列的C端含有鋅指結(jié)構(gòu)，它們屬于Group1；有5個(gè)基因的編碼蛋白序列的C端沒(méi)有鋅指結(jié)構(gòu)，屬于Group2。小麥 HD2基因編碼蛋白的序列長(zhǎng)度為312～472個(gè)氨基酸，分子量為3.37～5.17 kDa，理論等電點(diǎn)為4.60～8.78。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，所有的小麥HD2蛋白都定位于細(xì)胞核中。

表1 小麥 HD2基因qRT-PCR引物Table 1 Primers for qRT-PCR analysis of wheat HD2 genes

2.2 小麥 HD2基因系統(tǒng)進(jìn)化、保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析

為了分析小麥 HD2基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系，利用ClustalX軟件將小麥HD2蛋白和擬南芥、玉米、大麥和水稻中的HD2蛋白質(zhì)序列作多重比對(duì)(圖1A)。所有的小麥HD2蛋白質(zhì)序列與其他物種蛋白質(zhì)序列有34.29%的相似度，它們均在N端含有已報(bào)道的 HD2基因標(biāo)簽(MEFWG或MSSFWG)和兩個(gè)保守的氨基酸殘基，分別是位于25位的組氨酸殘基和位于72位的天冬氨酸殘基。其中TaHD2-G1-1B，TaHD2-G1-1A和TaHD2-G1-1D與HvHDAC2-1親緣關(guān)系更近，其蛋白質(zhì)序列相似度達(dá)到53.99%；TaHD2-G1-3A，TaHD2-G1-3B1和TaHD2-G1-3D1與HvHDAC2-2親緣關(guān)系更近；TaHD2-G1-3B1，TaHD2-G1-3D和TaHD2-G1-3A與ZmHDA106親緣關(guān)系更近，其蛋白質(zhì)序列相似度達(dá)到41.70%；而TaHD2-G2-2A,TaHD2-G2-5A,TaHD2-G2-5B和TaHD2-G2-5D則與AtHD2d親緣關(guān)系更近，蛋白質(zhì)序列相似度達(dá)到50.86%。以上結(jié)果表明，小麥中的Group1類型 HD2基因與同是禾本科的玉米和大麥比較相似，而Group2類型 HD2基因則與擬南芥中同屬于Group2類型 HD2基因的 AtHD2d相似。

用MEME對(duì)小麥HD2和其他植物的HD2蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。結(jié)果(圖1B)表明，所有鑒定到的小麥HD2和其他植物HD2均含有motif 2，這是HD2的gene label；TaHD2-G2-2A和AtHD2d結(jié)構(gòu)非常相似，只含有motif 2、motif 4和motif 8這三個(gè)motif；并且，TaHD2-G2-2A與同為Group2類型的HD2其他成員的結(jié)構(gòu)不同，說(shuō)明其可能在功能上與Group2類型的HD2其他成員存在差異。

根據(jù)Ensembl Plants上的小麥 HD2基因注釋信息，研究其內(nèi)含子-外顯子分布。結(jié)果表明，在同一染色體組的小麥 HD2基因中，其外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)非常相似，而在不同染色體組中則有差異。如：位于5號(hào)染色體上的 TaHD2基因，其外顯子-內(nèi)含子分布非常相似，他們都含有9個(gè)內(nèi)含子，且其長(zhǎng)度和分布非常相似。同樣的情況發(fā)生在1號(hào)染色體組和3號(hào)染色體組的 TaHD2-G1-3A、 TaHD2-G1-3B1和 TaHD2-G1-3D1上。 TaHD2-G2-2A與其他 TaHD2基因的結(jié)構(gòu)都不相同； TaHD2-G1-3B2和 TaHD2-G2-3D2位于進(jìn)化樹(shù)上的同一分支，且它們的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)非常相似，但它們并不屬于同一種類型的 HD2基因。以上結(jié)果表明，小麥 HD2基因在同一染色體組和屬于同一類型 HD2時(shí)，其染色體結(jié)構(gòu)非常相似。

Ta：Triticum aestivum；Zm：Zea mays；Hv：Hordeum vulgare；Os：Oryza sativa；At：Arabidopsis thaliana 圖1 小麥、擬南芥、玉米、水稻和大麥HD2蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(A)及蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域(B)分析Fig.1 Phylogenetic and protein conserved domain analysis of HD2 in wheat,Arabidopsis,maize,rice,and barley

表2 小麥 HD2基因在染色體上的定位Table 2 Chromosome location of HD2 genes in wheat

2.3 小麥 HD2基因染色體定位、順式作用元件及互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

根據(jù)基因組的注釋信息，進(jìn)行小麥 TaHD2基因的染色體定位；結(jié)果(表2)表明，所有鑒定到的12個(gè)小麥 HD2基因分布于小麥4個(gè)不同的染色體上，且這些基因在染色體上的分布并不均勻。1號(hào)染色體組和5號(hào)染色體組上A、B和D染色體均有一個(gè)基因；3號(hào)染色體組上含有5個(gè)基因；2號(hào)染色體組上只有一個(gè)基因。這表明，在小麥基因組中，位于3號(hào)染色體組上的 HD2基因可能發(fā)生了復(fù)制，產(chǎn)生多個(gè)拷貝，而位于2號(hào)染色體組上的 HD2基因可能發(fā)生缺失。

根據(jù)小麥與擬南芥中 HD2的同源基因，參考擬南芥基因互作網(wǎng)絡(luò)研究小麥 HD2基因與其他基因的互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)，只有一個(gè)小麥 HD2基因與其他小麥基因存在互作關(guān)系，形成121個(gè)分支。這些互作基因主要參與DNA和RNA的修飾，表明小麥 HD2基因主要通過(guò)DNA修飾或RNA修飾來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)。

為進(jìn)一步研究小麥 HD2基因可能的生物學(xué)功能和參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，選取所有鑒定到的小麥 HD2基因上游1.5 kb區(qū)域，用于順式作用元件的鑒定。結(jié)果表明，小麥 HD2基因上游序列中存在78個(gè)與脅迫及激素相關(guān)的順式作用元件，其中數(shù)量最多的是光響應(yīng)元件，表明小麥 HD2基因可能參與光合作用過(guò)程。所有的小麥 HD2基因上游區(qū)域均含有Skn-1模體，該元件在胚乳相關(guān)基因表達(dá)中起重要作用，表明小麥 HD2基因可能參與調(diào)控胚乳的生長(zhǎng)發(fā)育。另外，小麥 HD2基因的順式作用元件中還包含了多種非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件，包括干旱脅迫響應(yīng)元件MBS、熱脅迫響應(yīng)元件HSE、低溫脅迫響應(yīng)元件LTR和脫落酸脅迫響應(yīng)元件motif IIb等，表明小麥 HD2基因可能參與調(diào)控多種非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程。

圖2 基于擬南芥同源基因構(gòu)建的 HD2基因互作網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Interaction network of HD2 genes in wheat according to the orthologs in Arabidopsis

2.4 小麥 HD2基因在不同組織中和不同逆境脅迫下的表達(dá)模式分析

為了解小麥 HD2基因在不同組織中的表達(dá)模式，本研究從WheatExp獲取小麥 HD2基因在根、莖、葉、穗和種子中的表達(dá)量，然后利用Heml軟件將結(jié)果可視化(圖3A)。結(jié)果表明，除 TaHD2-G1-3B2外， TaHD2基因在所有組織中都有表達(dá)，且同一基因在不同組織、不同基因在同一組織下均存在顯著差異(P<0.05)。 TaHD2-G1-1A、 TaHD2-G1-1B和 TaHD2-G1-1D在除grain z85和root z10外的所有組織中的表達(dá)量均比其他 TaHD2基因高，且其表達(dá)模式相似，表明這三個(gè)基因在小麥整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中都較為重要。而 TaHD2-G1-3B2在所有組織中的表達(dá)量均非常低，在種子中甚至無(wú)表達(dá)，表明該基因可能不參與種子的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，這與擬南芥中 AtHD2d基因的表達(dá)模式相似，兩者可能具有相似的生物學(xué)功能。從整體上看，定位于同一染色體組上的小麥 HD2基因具有相似的表達(dá)模式。而對(duì)于 TaHD2-G1-3B2基因，其表達(dá)模式與其他位于3號(hào)染色體組上的小麥 HD2基因差異較大，表明其可能在小麥進(jìn)化過(guò)程中，由于染色體加倍或復(fù)制等原因，功能丟失或產(chǎn)生了新的功能。

為了解小麥 HD2基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式，本研究對(duì)從SRA數(shù)據(jù)庫(kù)下載的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到小麥在干旱脅迫、熱脅迫和旱熱共脅迫分別處理1和6 h的表達(dá)量，并使用Heml軟件將結(jié)果可視化(圖3B)。結(jié)果表明，隨干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)， TaHD2-G1-1A、 TaHD2-G1-1D和 TaHD2-G1-3B1的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)； TaHD2-G2-2A在熱脅迫1 h和旱熱共脅迫1 h的表達(dá)量比對(duì)照高10倍以上。其他基因的表達(dá)量無(wú)顯著變化。由此推測(cè)，這4個(gè)基因可能在小麥響應(yīng)熱脅迫和干旱脅迫的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

z10：第一片葉抽出胚芽鞘時(shí)期；Z13：3葉期；z23：3個(gè)分蘗時(shí)期；z30：穗長(zhǎng)為1 cm時(shí)期；z32：2個(gè)節(jié)時(shí)期；z39：減數(shù)分裂時(shí)期；z65：開(kāi)花期；z71：開(kāi)花后2天；z75：開(kāi)花后14天；z85：開(kāi)花后30天。

z10:First leaf through coleoptile; Z13:Three leaves stage; z23:Three tillers stage; z30:Spike of 1 cm stage； z32：Two nodesstage;z39:Meiosis; z65:Anthesis; z71:2 days after anthesis; z75:14 days after anthesis;z85:30 days after anthesis.

圖3小麥HD2基因在不同組織中(A)和不同逆境下(B)的表達(dá)模式

Fig.3ExpressionprofilesofHD2genesindifferenttissuesandunderdifferentstresses

2.5 小麥 HD2基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期熱脅迫下葉片中的表達(dá)模式

為研究 HD2基因在小麥不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的葉片響應(yīng)熱脅迫的表達(dá)模式，選取出芽3天、出芽7天、分蘗、春化、起身、拔節(jié)、挑旗、抽穗、開(kāi)花、灌漿早期、灌漿晚期和成熟期共12個(gè)時(shí)期的小麥(品種為農(nóng)科199)葉片，分別在35 ℃和42 ℃下進(jìn)行短期(1 h)熱脅迫處理，分析其表達(dá)量。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的表達(dá)量可以看出， TaHD2-G1-3B2和 TaHD2-G2-3D2在葉片中的表達(dá)量很低，幾乎為零，所以選取除這兩個(gè)基因以外的10個(gè) TaHD2基因，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行qRT-PCR。結(jié)果(圖4)表明，多數(shù)基因在挑旗期和抽穗期熱脅迫下表達(dá)量明顯上升，且 TaHD2-G1-1A基因上升得最明顯，表明多數(shù) TaHD2基因可能在小麥生長(zhǎng)發(fā)育的挑旗期和抽穗期對(duì)熱脅迫響應(yīng)具有重要作用。而少數(shù)基因，如 TaHD2-G2-5B僅在起身和挑旗期表達(dá)量明顯上升，其他時(shí)期熱脅迫下表達(dá)量均下降，說(shuō)明個(gè)別基因可能在別的時(shí)期熱脅迫下發(fā)揮重要作用。同時(shí)，與RNA-seq數(shù)據(jù)分析結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，部分基因，如 TaHD2-G1-3D1，在RNA-seq數(shù)據(jù)中熱脅迫下表達(dá)量下調(diào)，而在qRT-PCR結(jié)果中則在某些時(shí)期顯著上調(diào)，這是因?yàn)镽NA-seq數(shù)據(jù)檢測(cè)的是小麥幼苗時(shí)期熱脅迫下表達(dá)量，與qRT-PCR結(jié)果相比，小麥生長(zhǎng)發(fā)育早期熱脅迫下該基因表達(dá)也為下調(diào)，隨著小麥生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行，該基因在熱脅迫下逐漸呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，說(shuō)明小麥 HD2基因?qū)崦{迫的響應(yīng)在不同時(shí)期具有不同的表現(xiàn)。

3 討 論

本研究是利用生物信息學(xué)方法第一次系統(tǒng)研究小麥中的 HD2基因，共鑒定到12個(gè) HD2基因，相比于目前擬南芥(4個(gè))、水稻(2個(gè))、玉米(4個(gè))和大麥(2個(gè))中 HD2基因個(gè)數(shù)較多，這可能與其基因組較為龐大有關(guān)[24]，依據(jù)其蛋白肽鏈C端是否具有鋅指結(jié)構(gòu)將其分為兩組[8]。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究表明，這12個(gè)基因均具有 HD2基因的典型結(jié)構(gòu)。進(jìn)化分析結(jié)果表明，小麥中的Group 1類型 HD2基因與同是禾本科的玉米和大麥比較相似，而Group 2類型 HD2基因則與擬南芥中同屬于Group 2類型 HD2基因的 AtHD2d相似。說(shuō)明小麥中Group 1和Group 2類型的 HD2基因其進(jìn)化方面可能有較大區(qū)別。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，小麥 HD2基因可能參與了小麥中DNA和RNA修飾過(guò)程。通過(guò)研究這些基因的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)其上游包含多種脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件，表明小麥 HD2基因可能在小麥多種脅迫響應(yīng)中具有重要作用。在擬南芥中的研究表明， HD2基因可以與染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物或其他基因互作，參與逆境脅迫響應(yīng)過(guò)程[19-21]。結(jié)合共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，推測(cè)在逆境脅迫中，小麥 HD2基因也可能通過(guò)與其他基因互作，參與小麥DNA或RNA修飾，進(jìn)而參與逆境脅迫響應(yīng)過(guò)程。本研究利用RNA-seq數(shù)據(jù)，研究了小麥 HD2基因在不同組織下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)位于同一染色體組上的小麥 HD2基因具有相似的表達(dá)模式，特別的 TaHD2-G1-3B2表達(dá)模式與其他位于3號(hào)染色體組上的基因不同，可能的原因是在進(jìn)化過(guò)程中，其功能丟失或產(chǎn)生了新的功能。

X軸上的1～12依次代表小麥出芽3天、出芽7天、分蘗期、春化期、起身期、拔節(jié)期、挑旗期、抽穗期、開(kāi)花期、灌漿早期、灌漿晚期和成熟期。

1-12 on the X-axis represent the 12 growth periods of wheat including 3 days and 7 days after germination, tillering, vernalization, booting, jointing, flagging, heading, flowering, early grain filling, late filling and maturing stages of wheat,respectively.

圖4HD2基因在小麥品種科農(nóng)199不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)水平

Fig.4RelativeexpressionlevelsofTaHD2genesin12growthperiodsofwheat

研究表明， HD2基因在植物未成熟和成熟期對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)具有不同的表現(xiàn)，但是關(guān)于植物不同時(shí)期的具體不同表現(xiàn)目前尚不清楚[21]。熱脅迫是導(dǎo)致小麥產(chǎn)量和質(zhì)量下降的重要因素，本研究結(jié)果表明，小麥 HD2基因在挑旗期和抽穗期熱脅迫下表達(dá)量上升明顯，其可能在這兩個(gè)時(shí)期對(duì)小麥熱脅迫響應(yīng)具有重要作用。對(duì)于個(gè)別基因，如 TaHD2-G1-3A，除了在挑旗期和抽穗期外，其在拔節(jié)期、灌漿早期和成熟期熱脅迫下表達(dá)量也明顯上升，表明該基因可能在這三個(gè)時(shí)期的熱脅迫響應(yīng)也有重要作用。