， ，

膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，約占顱內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤的50%～60%，是最常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤[1]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤傳統(tǒng)的治療手段主要包括手術(shù)、放療、化療。然而，膠質(zhì)瘤的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、對(duì)放化療的耐受性使得膠質(zhì)瘤的整體治療效果欠佳[2]。磷酸核糖焦磷酸合成酶2(PRPS2)基因是編碼體內(nèi)嘌呤、嘧啶兩種核苷酸從頭合成、補(bǔ)救合成的關(guān)鍵酶基因。通過下調(diào)PRPS2基因表達(dá)，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，有望成為膠質(zhì)瘤基因治療的新思路[3]。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因啟動(dòng)子具有高腫瘤靶向性及較強(qiáng)的啟動(dòng)活性，從而成為腫瘤靶向基因治療中具有巨大潛力的啟動(dòng)子[4]。本研究擬通過hTERT啟動(dòng)子介導(dǎo)，利用RNAi技術(shù)下調(diào)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中PRPS2基因表達(dá)，研究其增殖、凋亡等生物學(xué)特性的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞由本室保存；pGGN-hTERT-PRPS2干擾載體購(gòu)自上海吉瑪基因化學(xué)技術(shù)有限公司；胎牛血清購(gòu)自四季青公司；DMEM購(gòu)自GIBCO公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自Promega公司；Effectene Transfection Reagent購(gòu)自QIAGEN公司；Cell Counting Kit8細(xì)胞增殖(CCK-8)試劑盒、Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物公司；Hoechst 33342購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 RT-PCR檢測(cè) 采用RT-PCR方法檢測(cè)干擾載體對(duì)U251細(xì)胞中PRPS2的mRNA水平的影響。取RNA 2 μg，5×PrimeScript Buffer 4 μL，加RNase Free dH2O至總體積20 μL，37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s，反轉(zhuǎn)錄得cDNA。PCR 擴(kuò)增人PRPS2基因，上游引物為：5′- GATTGCGTCATCATCCAG AGT-3′；下游引物為：5′- CATTCGCCTTCTTCCTCTCT T-3′。引物由上海生工公司合成。反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共30 個(gè)循環(huán)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室保存，含10%胎牛血清的Gibco高糖培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2、相對(duì)濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%的胰酶消化，每2 d換液傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 轉(zhuǎn)染 參考說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。設(shè)空白對(duì)照組(無干預(yù))、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pGGN-hTERT-PRPS2-C載體)和實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染pGGN-hTERT-PRPS2-si載體)。

1.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PRPS2表達(dá)改變對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。將 96孔板每孔接種100 μL，約2 000個(gè)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450。

1.6 Hoechst 33342染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡與壞死 采用Hoechst 33342染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡與壞死情況。在6孔板中，每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72 h后，每孔加入5 μL Hoechst 33342染色液，混勻，4 ℃染色20 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗1次，熒光顯微鏡觀察。

1.7 Annexin V/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡與壞死 采用Annexin V/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡與壞死情況。用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞；用PBS洗滌細(xì)胞2次(1 000 r/min離心5 min)收集1×105～5×105細(xì)胞；加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-EGFP混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻；室溫、避光、反應(yīng)15 min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 細(xì)胞周期分布檢測(cè) 通過流式細(xì)胞儀采用PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。首先，用胰酶消化收集細(xì)胞；用PBS洗滌細(xì)胞2次，常溫2 000 r/min離心5 min后收集1×106細(xì)胞；棄去上清，加入1.5 mL PBS，拍打成細(xì)胞懸液，加預(yù)冷的70%乙醇；4 ℃固定過夜；1 500 r/min離心5 min，棄去上清，PBS沖洗后加入100 μL RNase A，37 ℃水浴保溫30 min，再加入400 μL PI染色液混勻，4 ℃避光30 min，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 干擾載體對(duì)U251細(xì)胞PRPS2表達(dá)的影響 分別將PRPS2干擾載體轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞72 h后，收集并分別提取總RNA和總蛋白。RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PRPS2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組細(xì)胞中PRPS2相對(duì)表達(dá)量與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中PRPS2的相對(duì)表達(dá)量較陰性對(duì)照組明顯下降(0.39±0.05與0.99±0.09，t=-13.21，P<0.05)。詳見圖1。

A為空白對(duì)照組；B為陰性對(duì)照組；C為實(shí)驗(yàn)組。與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2 PRPS2表達(dá)下調(diào)對(duì)U251細(xì)胞增殖能力的影響 采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組細(xì)胞活性與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而轉(zhuǎn)染48 h后，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比，U251細(xì)胞活性明顯降低(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組在轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞活性降低15.5%，轉(zhuǎn)染72 h后降低16.1%，說明PRPS2表達(dá)下調(diào)對(duì)U251細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。詳見表1。

表1 PRPS2表達(dá)下調(diào)對(duì)U251細(xì)胞增殖能力的影響(±s)

2.3 PRPS2表達(dá)下調(diào)對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響 Hoechst33342細(xì)胞染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組細(xì)胞核呈均勻淡色，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞核染色質(zhì)高度聚集，可見亮藍(lán)色小點(diǎn)，有的甚至亮到發(fā)白，有的出現(xiàn)核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體。詳見圖2。進(jìn)一步采用Annexin V/PI雙染色法對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行定量。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(18.41±1.60)% 與(17.93±1.79)%，t=0.44，P>0.05]；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為(27.16±1.57)%，與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.70，P<0.05)，說明下調(diào)PRPS2基因的表達(dá)可顯著增加U251細(xì)胞的凋亡。詳見圖3。

A為空白對(duì)照組；B為陰性對(duì)照組；C為實(shí)驗(yàn)組

A為空白對(duì)照組；B為陰性對(duì)照組；C為實(shí)驗(yàn)組。與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05

2.4 PRPS2表達(dá)下調(diào)對(duì)U251細(xì)胞周期的影響 分別將PRPS2干擾載體轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞72 h后進(jìn)行PI染色后，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，各個(gè)階段細(xì)胞數(shù)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PRPS2基因表達(dá)下調(diào)后，U251細(xì)胞的周期發(fā)生明顯變化，G1期細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)，S期細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)，G2/M期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明PRPS2基因低表達(dá)能夠?qū)е耈251細(xì)胞阻滯于G0/G1期，細(xì)胞分裂減緩。詳見表2、圖4。

表2 PI染色檢測(cè)下調(diào)PRPS2表達(dá)對(duì)U251細(xì)胞周期的影響(±s) %

A為空白對(duì)照組；B為陰性對(duì)照組；C為實(shí)驗(yàn)組

圖4 PI染色檢測(cè)PRPS2表達(dá)下調(diào)對(duì)U251細(xì)胞周期的影響

3 討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，具有高發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、死亡率和低治愈率的特點(diǎn)。因?yàn)閭鹘y(tǒng)手術(shù)、放化療等治療手段的局限性，所以從分子機(jī)制角度研究膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展，為臨床提供新的治療策略就顯得尤為重要。文志華等[5]研究發(fā)現(xiàn)花生四烯酸乙醇胺可通過神經(jīng)酰胺從頭合成通路，與神經(jīng)酰胺呈濃度依賴性協(xié)同作用，從而抑制人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其早期凋亡。薛歡鴿等[6]通過siRNA靶向沉默ABCE1基因，可顯著降低U251細(xì)胞的增殖和遷移能力。朱虹帆等[7]發(fā)現(xiàn)人膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞較正常腦組織CEP55表達(dá)明顯增高，抑制CEP55的表達(dá)可抑制人膠質(zhì)瘤251細(xì)胞的增殖，同時(shí)促進(jìn)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。陳照亮等[8]利用miR-592通過直接靶向Runx2來誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。

PRPS2編碼的PRPP是體內(nèi)嘌呤、嘧啶從頭合成和補(bǔ)救合成的重要底物，同時(shí)也是該通路上的重要調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用[9]。阻斷腫瘤細(xì)胞核苷酸的合成也是目前臨床廣泛應(yīng)用的抗代謝類腫瘤化療藥物的作用機(jī)制。阻斷PRPS2的表達(dá)可有效阻斷增殖較快的組織中核苷酸從頭合成途徑，進(jìn)而阻斷腫瘤細(xì)胞的增殖。陳穎等[10]下調(diào)宮頸癌hela細(xì)胞中PRPS2基因的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)hela細(xì)胞活性及增殖能力降低、細(xì)胞遷移能力下降。Xue等[11]研究神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)病機(jī)制中關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因MYCN，發(fā)現(xiàn)PRPS2與SDC1共同受到MYCN和TFAP4調(diào)控后參與神經(jīng)病母細(xì)胞瘤的增殖及轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞的新陳代謝與正常細(xì)胞不同，Burkhart等[12]對(duì)腫瘤細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境發(fā)生改變時(shí)代謝相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)HUR在胰腺癌細(xì)胞對(duì)抗缺糖損傷時(shí)的應(yīng)激性新陳代謝中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而PRPS2是HUR調(diào)控的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一，與HUR的表達(dá)呈正相關(guān)。

hTERT啟動(dòng)子在正常細(xì)胞中無活性，而在腫瘤細(xì)胞中有顯著活性。利用hTERT啟動(dòng)子構(gòu)建腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)載體，并將其利用在腫瘤基因靶向治療中，有良好的腫瘤特異性和安全性，對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡和腫瘤的抑制有良好的效果[13]。諸多研究利用hTERT啟動(dòng)子介導(dǎo)不同目的基因的表達(dá)，研究其對(duì)腫瘤的作用。Jacob等[14]通過構(gòu)建hTERT啟動(dòng)子介導(dǎo)調(diào)控TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)基因表達(dá)載體，僅在卵巢癌細(xì)胞中發(fā)揮作用，而不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生影響，特異性干擾促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。Li等[15]構(gòu)建了hTERT啟動(dòng)子介導(dǎo)調(diào)控TRAIL基因的腺病毒載體和巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動(dòng)子介導(dǎo)調(diào)控TRAIL基因的腺病毒載體，并在體內(nèi)、體外進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)hTERT啟動(dòng)子的啟動(dòng)能力略微低于巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，但是其對(duì)正常細(xì)胞無影響，而促進(jìn)了人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。Kalinichenko等[16]將hTERT啟動(dòng)至與antioxidant response element (ARE) 相結(jié)合，增強(qiáng)了NRF-2轉(zhuǎn)錄因子腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步提升了5-氟尿嘧啶對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷特異性。

上述研究與本研究有良好的一致性，證明利用hTERT啟動(dòng)子構(gòu)建腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)載體在腫瘤基因靶向治療中有良好的應(yīng)用前景，該方法有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。本研究利用RNAi技術(shù)，通過hTERT啟動(dòng)子介導(dǎo)PRPS2表達(dá)下調(diào)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞凋亡明顯增高。由此可見，PRPS2在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。在細(xì)胞周期的檢測(cè)中，PRPS2表達(dá)下調(diào)后，U251細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯。

利用hTERT啟動(dòng)子構(gòu)建PRPS2下調(diào)載體在膠質(zhì)瘤基因靶向治療中，有良好的應(yīng)用前景，該方法有望為膠質(zhì)瘤治療提供新的思路。