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2型糖尿病是以慢性高血糖為主要特征的一種代謝性疾病，病理特征為胰島素調(diào)控葡萄糖代謝能力的下降及胰島β細(xì)胞功能缺陷所導(dǎo)致的胰島素分泌減少[1]。越來(lái)越多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)2型糖尿病存在胰腺β細(xì)胞數(shù)量減少[2]。尸檢結(jié)果表明，糖尿病病人較正常人，胰腺β細(xì)胞凋亡增加進(jìn)而體積減小[3]。因此，促進(jìn)β細(xì)胞增殖且抑制其凋亡是2型糖尿病治療的重要方面。

京尼平苷(geniposide，GP)是中藥梔子的有效成分，是一種新的胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)受體激動(dòng)劑[4]。研究認(rèn)為GLP-1受體激動(dòng)劑能促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡[5- 6]。本實(shí)驗(yàn)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素[7](thapsigargin，Thap)處理大鼠胰島β細(xì)胞系(INS-1)，觀察京尼平苷對(duì)INS-1細(xì)胞增殖及凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠INS-1購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)(北京總部)；京尼平苷購(gòu)自日本W(wǎng)ako公司；GLP-1購(gòu)自英國(guó)TOCRIS公司；毒胡蘿卜素購(gòu)自Sigma公司；CCK-8、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自日本東仁公司；胎牛血清購(gòu)自BI公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、胰蛋白酶、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自生工生物公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2 儀器 電子天平購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；倒置顯微鏡購(gòu)自?shī)W林巴斯公司；二氧化碳(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIoTek公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海智城分析儀器有限公司。

1.3 INS-1細(xì)胞的培養(yǎng) INS-1細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素、50 μmol/L β-巰基乙醇的RPMI 1640培養(yǎng)液，置5% CO237 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合至70%～80%，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.4 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖 將INS-1細(xì)胞按1×104密度接種至96孔板，過(guò)夜后，用對(duì)照組、京尼平苷組、GLP-1組方法處理細(xì)胞24 h，棄培養(yǎng)液，按10∶1比例將培養(yǎng)液與CCK-8混勻，加入96孔板，孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm下測(cè)吸光度(OD值)。

1.5 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡 INS-1細(xì)胞以1×106接種于6孔板，過(guò)夜后，按對(duì)照組、毒胡蘿卜素組、毒胡蘿卜素+京尼平苷組、毒胡蘿卜素+GLP-1組處理細(xì)胞6 h。棄培養(yǎng)液，PBS洗1次，加0.25%的胰酶消化5 min，培養(yǎng)液終止消化。將細(xì)胞懸液收集到離心管中，1 000 r/min離心3 min。棄上清，加入預(yù)冷的PBS重懸，用300目濾網(wǎng)過(guò)濾，再次離心，棄上清，加入1×Annexin V binding buffer調(diào)整細(xì)胞量，加入Annexin V-FITC、PI Solution各5 μL，混勻，室溫避光15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力 將INS-1細(xì)胞按1×104密度接種至96孔板，過(guò)夜后，按對(duì)照組、毒胡蘿卜素組、毒胡蘿卜素+京尼平苷組、毒胡蘿卜素+GLP-1組方法處理細(xì)胞6 h。棄培養(yǎng)液，加入 CCK-8與培養(yǎng)液的混合液，孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm下測(cè)吸光度(OD值)，并計(jì)算細(xì)胞存活率：存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔-空白孔)/(對(duì)照孔-空白孔)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 京尼平苷對(duì)INS-1細(xì)胞增殖的影響 用不同濃度的京尼平苷(1 μmol/L～100 μmol/L)和GLP-1(10 nmol/L)干預(yù)大鼠INS-1 24 h，發(fā)現(xiàn)京尼平苷同GLP-1一樣，均能促進(jìn)INS-1細(xì)胞的增殖，并有濃度依賴性。詳見(jiàn)圖1。

與Control比較，*P<0.01

圖1京尼平苷對(duì)INS-1細(xì)胞增殖的影響

2.2 京尼平苷對(duì)Thap致INS-1細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用 用毒胡蘿卜素(1 μmol/L)處理INS-1細(xì)胞6 h，發(fā)現(xiàn)毒胡蘿卜素組細(xì)胞早期凋亡率增加，毒胡蘿卜素+京尼平苷(1 μmol/L～100 μmol/L)組或GLP-1(10 nmol/L)組早期凋亡率減少，提示京尼平苷或GLP-1均能減輕毒胡蘿卜素導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，且京尼平苷的抗凋亡作用具有濃度依賴性。詳見(jiàn)圖 2、圖3。

圖2 各組細(xì)胞凋亡流式圖

與control比較，*P<0.01；與Thap比較，#P<0.01

圖3各組細(xì)胞凋亡率

2.3 京尼平苷對(duì) Thap致INS-1細(xì)胞毒性的影響 用毒胡蘿卜素(1 μmol/L)處理INS-1細(xì)胞6 h，同時(shí)用京尼平苷(10 μmol/L)及GLP-1(10 nmol/L)干預(yù)，可見(jiàn)毒胡蘿卜素組細(xì)胞活力下降，數(shù)量減少，而京尼平苷及GLP-1可減弱毒胡蘿卜素對(duì)細(xì)胞的毒性作用。詳見(jiàn)圖 4。

與Control比較，*P<0.01；與Thap比較，#P<0.01

圖4京尼平苷對(duì)Thap致INS-1細(xì)胞毒性的影響

3 討 論

糖尿病是一種慢性終身性疾病，需要長(zhǎng)期藥物治療。隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)，疾病的進(jìn)展，胰島素治療成為很多病人不可避免的治療方式。胰島素降糖效果明確，但注射疼痛、低血糖頻發(fā)、體重增加等副作用，以及由此帶來(lái)的嚴(yán)重心理負(fù)擔(dān)時(shí)刻困擾著病人。GLP-1受體激動(dòng)劑的出現(xiàn)在一定程度上解決了上述難題。GLP-1受體激動(dòng)劑是葡萄糖濃度依賴性的胰島素促泌劑，具有注射次數(shù)少、低血糖發(fā)生概率小、可降低體重等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為糖尿病治療的新方向。中藥梔子的主要活性成分京尼平苷是一種新型的GLP-1受體激動(dòng)劑。多項(xiàng)研究均證實(shí)，京尼平苷具有葡萄糖依賴性的促胰島素分泌作用[4，8]，且無(wú)須注射，可經(jīng)胃腸道給藥[9-10]，因此關(guān)于京尼平苷的研究越來(lái)越受到科研人員的重視。

人體血糖的平穩(wěn)與胰島β細(xì)胞的數(shù)量密切相關(guān)[11]。β細(xì)胞的增殖、再生與死亡、清除一起維持著體內(nèi)胰島β細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)平衡。因此，促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖，抑制其凋亡是糖尿病治療的重要途徑。研究表明，GLP-1受體激動(dòng)劑能促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。本實(shí)驗(yàn)用京尼平苷干預(yù)大鼠INS-1，并用GLP-1作為陽(yáng)性對(duì)照，觀察京尼平苷對(duì)INS-1細(xì)胞增殖和凋亡的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，京尼平苷可濃度依賴性地促進(jìn)INS-1細(xì)胞的增殖，但促增殖能力低于GLP-1。毒胡蘿卜素是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶選擇性抑制劑，可以不可逆地使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣池排空，使胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)升高，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)并最終發(fā)生凋亡[12]。本實(shí)驗(yàn)用毒胡蘿卜素處理INS-1細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)用京尼平苷或GLP-1共孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毒胡蘿卜素處理后，INS-1細(xì)胞發(fā)生了明顯的凋亡，早期凋亡率達(dá)到(15.72±0.57)%。而用京尼平苷干預(yù)后，細(xì)胞早期凋亡率明顯下降，最低達(dá)(5.11±0.25)%，并呈濃度依賴性，且抑制凋亡的作用強(qiáng)于陽(yáng)性藥物GLP-1[早期凋亡率(9.23±0.35)%]。同時(shí)，用CCK-8法測(cè)定了毒胡蘿卜素處理后的細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)京尼平苷同GLP-1一樣，能減輕毒胡蘿卜素對(duì)INS-1細(xì)胞的毒性作用，增加細(xì)胞活力。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，京尼平苷能夠促進(jìn)INS-1細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，同既往文獻(xiàn)報(bào)道[9，13]是一致的，說(shuō)明京尼平苷可通過(guò)促進(jìn)胰島β細(xì)胞數(shù)量的增加，抑制β細(xì)胞數(shù)量減少，從而維持體內(nèi)一定的胰島素分泌量來(lái)保持血糖穩(wěn)定，起到降糖的作用。