司新鵬

摘 要：目的 以人肺癌細(xì)胞株A549為研究對(duì)象，觀察不同濃度/時(shí)間下索拉尼非對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的增殖及其對(duì)VEGFR-2、VEGFR-3、P-VEGFR-2及P-VEGFR-3表達(dá)的影響。方法 不同濃度的索拉非尼（1.5 μmol/L、3 μmol/L、6 μmol/L、12 μmol/L）分別與A549細(xì)胞體外培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。采用RT-PCR法測(cè)定不同藥物濃度/時(shí)間下肺癌細(xì)胞株A549中VEGFR-2mRNA、VEGFR-3mRNA的表達(dá)變化，用Western Blot法測(cè)定P-VEGFR-2及P-VEGFR-3的表達(dá)。結(jié)果 在外源性藥物索拉非尼的刺激下，肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)受到抑制，索拉非尼的濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制率越大，提示呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性（P<0.05）。以終濃度為1.5 μmol/L、3 μmol/L、6 μmol/L、12 μmol/L的索拉非尼加入實(shí)驗(yàn)組，在不同的作用時(shí)間（24 h、48 h、72 h）下，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較VEGFR-2mRNA及VEGFR-3mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化（P>0.05）。P-VEGFR-2及P-VEGFR-3的表達(dá)與對(duì)照組比較呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（P<0.05），呈濃度依賴性。結(jié)論 索拉非尼能抑制A549肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性。索拉非尼能抑制A549肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，其機(jī)制之一可能與其抑制P-VEGFR-2及P-VEGFR-3的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：索拉非尼；A549肺癌細(xì)胞；VEGFR-2；VEGFR-3；P-VEGFR-2；P-VEGFR-3

中圖分類號(hào)：R734.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.17.003

文章編號(hào)：1006-1959（2018）17-0008-06

Abstract：Objective The proliferation of human lung cancer cell line A549 and its effects on the expression of VEGFR-2，VEGFR-3， P-VEGFR-2 and P-VEGFR-3 were observed at different concentrations/time.Methods Different concentrations of sorafenib（1.5μmol/L，3μmol/L，6μmol/L，12μmol/L）were cultured with A549 cells for 24，48 and 72h respectively.The inhibition rate of cell growth was determined by tetramethylazo blue colorimetry.The expression of VEGFR-2 mRNA and VEGFR-3 mRNA in lung cancer cell line A549 was detected by RT-PCR and the expression of P-VEGFR-2 and P-VEGFR-3 was detected by Western Blot.Results Under the stimulation of the exogenous drug sorafenib，the growth of lung cancer cell A549 was inhibited.The higher the concentration of sorafenib， the longer the duration of action，the greater the inhibition rate， suggesting time- and concentration-dependent（P<0.05）. Sorafenib at a final concentration of 1.5μmol/L，3μmol/L，6μmol/L，and 12μmol/L was added to the experimental group at different time（24h，48h，72h），there was no significant difference in the expression of VEGFR-2 mRNA and VEGFR-3 mRNA between the experimental group and the control group（P>0.05）.The expression of P-VEGFR-2 and P-VEGFR-3 decreased in a concentration-dependent manner compared with the control group（P<0.05）.Conclusion Sorafenib can inhibit the growth of A549 lung cancer cells in a time-and concentration-dependent manner.Sorafenib can inhibit the growth of A549 lung cancer cells，and one of its mechanisms may be related to its inhibition of P-VEGFR-2 and P-VEGFR-3 expression.

Key words：Sorafenib；A549 lung cancer cells；VEGFR-2；VEGFR-3；P-VEGFR-2；P-VEGFR-3

隨著腫瘤分子生物學(xué)的研究進(jìn)展，腫瘤分子靶向治療已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)，在多種腫瘤的治療中發(fā)揮了重要作用。分子靶向治療已使眾多腫瘤患者受益，目前已有多種靶向治療藥物上市并在某些腫瘤的臨床試驗(yàn)中證實(shí)有效[1]。然而，大部分腫瘤的生物學(xué)行為并非由單一信號(hào)傳導(dǎo)通路所支配，而是多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路共同起作用的，因此，針對(duì)多靶點(diǎn)進(jìn)行靶向治療可能會(huì)取得更好的療效[2]。索拉非尼是一種小分子多靶點(diǎn)的生物靶向治療新藥，是首個(gè)口服多激酶抑制劑，目前已成為腫瘤學(xué)界倍受關(guān)注的抗腫瘤藥物之一[3]。大量的體外腫瘤細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型以及臨床研究都已證實(shí)，索拉非尼的療效是可喜的，使抗腫瘤從化療和免疫治療階段邁入了靶向治療的時(shí)代[4]。拜耳和Onyx藥業(yè)公司從腫瘤的發(fā)生機(jī)理和腫瘤生長(zhǎng)需要新生血管提供營(yíng)養(yǎng)入手，聯(lián)合研制了索拉非尼（sorafenib）。索拉非尼能作用于多個(gè)靶點(diǎn)，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用。索拉非尼既能直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，又能通過(guò)抑制血管新生，達(dá)到腫瘤饑餓療法的目的[5]。2005年12月20日獲美國(guó)FDA快速批準(zhǔn)了其作為晚期腎細(xì)胞癌的一線治療藥物，是美國(guó)FDA10年來(lái)批準(zhǔn)的第一個(gè)治療腎癌的藥物。目前研究表明，索拉非尼對(duì)肝癌、非小細(xì)胞肺癌以及黑色素瘤等也有療效[6]。本研究以人肺癌細(xì)胞株A549為研究對(duì)象，觀察不同濃度/時(shí)間下索拉尼非對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的增殖及其對(duì)VEGFR-2、VEGFR-3、P-VEGFR-2及P-VEGFR-3表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料與試劑 肺腺癌細(xì)胞A549，泰安市中心醫(yī)院；小牛血清；RPMI1640粉劑；胰蛋白酶；索拉非尼；P-VEGFR-2多克隆抗體（兔抗人）；P-VEGFR-3多克隆抗體（兔抗人）；堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗（抗兔）。

1.2主要設(shè)備 倒置顯微鏡 IX70，Olympus；細(xì)胞培養(yǎng)箱（311型）；電子天平；超凈工作臺(tái) SW-CJ-1F；60 mm培養(yǎng)皿；低溫超速離心機(jī)；立時(shí)壓力蒸汽滅菌器；紫外分光光度計(jì)；垂直平板；電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、半干電轉(zhuǎn)移儀；GDS 8000型凝膠成像分析系統(tǒng)；氣浴恒溫振蕩器；DDY-2C型電泳儀；電熱恒溫水溫箱；加樣槍（1000 μl、100 μl和0.5～10 μl）Eppendorf，德國(guó)；烘干箱。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 將取出的凍存管直接投入37 ℃溫水中，并輕輕搖動(dòng)令其盡量融化。從37 ℃水浴中取出凍存管，用酒精消毒后開(kāi)啟，用吸管吸出細(xì)胞懸液，注入離心管并滴加10倍以上體積的培養(yǎng)液，混合后低速離心800 rpm，5 min。除去上清液，再重復(fù)用培養(yǎng)液洗一次。用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4細(xì)胞給藥 取第4代肺癌細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋瓶底80%，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，接種于96、6孔無(wú)菌培養(yǎng)板，置于5%CO2、37 ℃飽和濕度下。至細(xì)胞單層鋪滿孔底，按下述分組給藥：①正常對(duì)照組，不加任何藥物。②以終濃度為1.5 μmol/L、3 μmol/L、6 μmol/L、12 μmol/L的濃度梯度加入各組。四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率，用RT-PCR檢測(cè)VEGFR-2mRNA、VEGFR-3mRNA的表達(dá)，用Western blot檢測(cè)P-VEGFR-2、P-VEGFR-3的表達(dá)。

1.5輸入計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行密度分析 將Western Blot曝光膠片進(jìn)行圖像掃描，用GIS1000分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值的數(shù)字化，目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。為消除掃描和分析中的誤差，重復(fù)三次該過(guò)程，并取均值作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，結(jié)果以（x±s）表示。多組間均數(shù)比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1索拉非尼抑制細(xì)胞增殖試驗(yàn) 索拉非尼作用于A549肺癌細(xì)胞的抑制率在同一時(shí)間點(diǎn)、不同濃度組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），同一濃度組不同時(shí)間點(diǎn)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。MTT結(jié)果顯示：隨著藥物濃度的增大，藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，索拉非尼對(duì)肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)的抑制率越大。說(shuō)明索拉非尼能抑制肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)，呈現(xiàn)一定的劑量-時(shí)間依賴關(guān)系（P<0.05）。

2.2索拉非尼對(duì)P-VEGFR-2、P-VEGFR-3的表達(dá)的影響

2.2.1索拉非尼對(duì)P-VEGFR-2表達(dá)的影響 采用半定量Western Blot方法，應(yīng)用Quantity one v4.62生物圖像處理軟件測(cè)定對(duì)Western-Bolt圖片進(jìn)行分析，結(jié)果與β-action的相對(duì)光密度比值表示。結(jié)果顯示：索拉作尼作用于肺癌細(xì)胞A549 24 h、48 h、72 h后，P-VEGFR-2的表達(dá)水平與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同一時(shí)間點(diǎn)組間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同一濃度不同時(shí)間點(diǎn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。說(shuō)明不同濃度的索拉非尼對(duì)A549肺癌細(xì)胞P-VEGFR-2的表達(dá)有抑制作用：索拉非尼濃度越高，抑制作用越強(qiáng)，提示呈濃度依賴性。

2.2.2索拉非尼對(duì)P-VEGFR-3表達(dá)的影響 采用半定量Western Blot方法，應(yīng)用Quantity one v4.62生物圖像處理軟件測(cè)定對(duì)Western-Bolt圖片進(jìn)行分析，結(jié)果與β-action的相對(duì)光密度比值表示。結(jié)果顯示：索拉作尼作用于肺癌細(xì)胞A549 24 h、48 h、72 h后，P-VEGFR-3的表達(dá)水平與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同一時(shí)間點(diǎn)組間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同一濃度不同時(shí)間段比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表3。說(shuō)明不同濃度的索拉非尼對(duì)A549肺癌細(xì)胞P-VEGFR-3的表達(dá)有抑制作用：索拉非尼濃度越高，抑制作用越強(qiáng)，提示呈濃度依賴性。

2.3索拉非尼對(duì)VEGFR-2mRNA、VEGFR-3mRNA表達(dá)的影響

2.3.1索拉非尼對(duì)VEGFR-2mRNA表達(dá)的影響 加入藥物索拉非尼作用24 h、48 h、72 h后，肺癌細(xì)胞A549 VEGFR-2mRNA/GAPDH PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)比值，同一時(shí)間不同濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），同一濃度不同時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表4。

2.3.2索拉非尼對(duì)VEGFR-3mRNA表達(dá)的影響 加入藥物索拉非尼24 h、48 h、72 h后，肺癌細(xì)胞A549 VEGFR-3mRNA/GAPDH PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)比值，同一時(shí)間不同濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），同一濃度不同時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表5。

3討論

索拉非尼是拜耳和ONYX公司共同研制的一種多靶點(diǎn)的生物靶向新藥，目前索拉非尼用于肝癌治療的3期臨床試驗(yàn)已完成患者入組，正在進(jìn)行中。此外，2006年11月30日索拉非尼在中國(guó)上市。索拉非尼對(duì)黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等實(shí)體瘤亦有潛在的抗腫瘤效應(yīng)，其用于轉(zhuǎn)移性黑素瘤、皮膚癌、非小細(xì)胞肺癌的臨床試驗(yàn)亦在進(jìn)行中。目前對(duì)于索拉非尼的研究尚處于起步階段。

為了準(zhǔn)確的檢測(cè)不同濃度/時(shí)間下索拉非尼對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的體外抑制作用，本實(shí)驗(yàn)采用MTT比色法對(duì)加入藥物后的肺癌細(xì)胞A549活性進(jìn)行檢測(cè)。MTT比色法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確，廣泛用于細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等[6]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：不同濃度/時(shí)間下索拉非尼對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的抑制率不同。在同一時(shí)間點(diǎn)，各濃度組細(xì)胞抑制率較陰性對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并隨著藥物濃度的增加，其抑制效果越明顯，各濃度組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示當(dāng)作用時(shí)間相同時(shí)，索拉非尼的濃度越大，對(duì)肺癌細(xì)胞A549的抑制率就越大。同一濃度組不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較，抑制率較陰性對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。并隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制效果越明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示藥物濃度相同時(shí)，作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制率就越大。索拉非尼能夠抑制肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)；隨著索拉非尼濃度越大，作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制率就越大，呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性。

索拉非尼具有雙重抗腫瘤作用，它可以通過(guò)抑制上述RAF/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路直接抑制腫瘤生長(zhǎng)。RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路是細(xì)胞周期調(diào)控、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中的主要途徑，而RAF為該通路中的關(guān)鍵激酶，它有3個(gè)同工酶，分別為A-RAF、B-RAF與C-RAF，它們均與細(xì)胞增殖、分化及血管生成的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。大部分刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的因子，包括EGF、PDGF、VEGF和c-KIT，與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，即可通過(guò)受體酪氨酸激酶自體磷酸化的方式首先激活RAS，RAS又進(jìn)一步激活RAF/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，將生長(zhǎng)因子的信號(hào)帶入細(xì)胞核，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶活性的增加、RAS基因突變和過(guò)度表達(dá)以及RAF基因突變都可導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)通路的過(guò)度激活，從而引起細(xì)胞的過(guò)度增殖。已知在人類腫瘤細(xì)胞中A-RAF和C-RAF突變非常少見(jiàn)，B-RAF突變占7%，RAS基因突變占15%～30%。30%卵巢癌、35%～53%甲狀腺癌、30%結(jié)腸癌以及50%～70%惡性黑色素瘤中有B-RAF基因突變。索拉非尼正是通過(guò)抑制RAF活性從而阻斷了RAF/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，直接抑制腫瘤生長(zhǎng)。

索拉非尼還可以通過(guò)抑制幾種與血管生成和腫瘤發(fā)展有關(guān)的酪氨酸激酶受體的活性，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2（VEGFR-2），VEGFR-3，血小板衍生的生長(zhǎng)因子受體-β（PDGFR-β）和c-KIT原癌基因，阻斷腫瘤新生血管生成，間接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而起到抗腫瘤作用。VEGF刺激VEGFR-2、VEGFR-3，介導(dǎo)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞DNA合成和增殖。其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要是通過(guò)ERK通路，使VEGFR-2及VEGFR-3酪氨酸磷酸化，通過(guò)中間一些未知機(jī)制激活ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而引起血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)引起腫瘤生長(zhǎng)。

通過(guò)目前對(duì)VEGF/VEGFR信號(hào)通路作用機(jī)制的了解，可以得到以下幾種可能的抑制劑研究方向：①利用單克隆抗體抑制VEGF或VEGFR，使其不能特異性結(jié)合，阻斷信號(hào)傳導(dǎo)，也可以利用基因技術(shù)抑制它們的表達(dá)，減弱其活性。②設(shè)計(jì)特定的小分子抑制劑，結(jié)合到VEGFR胞外VEGF結(jié)合區(qū)域，競(jìng)爭(zhēng)性拮抗VEGF，同理，也可以是結(jié)合到VEGF上VEGFR的特定結(jié)合域，競(jìng)爭(zhēng)性拮抗VEGFR。③抑制VEGFR的胞內(nèi)激酶域，主要是ATP的結(jié)合位點(diǎn)，競(jìng)爭(zhēng)性地拮抗ATP，使其無(wú)法提供γ磷酸基。④抑制胞內(nèi)的VEGFR下游信號(hào)的關(guān)鍵性蛋白。

本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR檢測(cè)VEGFR-2mRNA、VEGFR-3mRNA的表達(dá)。它是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過(guò)PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。RT-PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RNA。RT-PCR廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測(cè)某種RNA的含量。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)藥物作用24、48、72 h后，同一濃度不同時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），同一時(shí)間不同濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示當(dāng)用索拉非尼處理后，總的VEGFR-2mRNA、VEGFR-3mRNA的表達(dá)并沒(méi)有發(fā)生變化。說(shuō)明索拉非尼的多靶點(diǎn)抗腫瘤作用并不是直接通過(guò)VEGFR-2、VEGFR-3起作用。國(guó)內(nèi)在這方面的報(bào)道甚少。國(guó)外學(xué)者采用Western Blot檢測(cè)索拉非尼對(duì)VEGFR-2mRNA的表達(dá)影響，結(jié)果顯示，總的VEGFR-2mRNA的表達(dá)沒(méi)有發(fā)生變化。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果和國(guó)外文獻(xiàn)結(jié)果一致[7]。另外，本實(shí)驗(yàn)研究了索拉非尼對(duì)VEGFR-3mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，總的VEGFR-3mRNA的表達(dá)也沒(méi)有發(fā)生變化。

國(guó)外學(xué)者研究索拉非尼抑制VEGFR-2的自身磷酸化在兩種細(xì)胞系中被觀察到，分別是HUVECs和NIH 3T3細(xì)胞系，在HUVECs的實(shí)驗(yàn)中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子強(qiáng)烈誘導(dǎo)著受體VEGFR-2自身磷酸化，但是這一點(diǎn)被索拉非尼阻滯。在100 nmol/L的索拉非尼時(shí)，50%的受體VEGFR-2被抑制。同樣的在NIH 3T3的試驗(yàn)中，觀察到同樣的現(xiàn)象[8，9]。這些研究結(jié)果表明，索拉菲尼是一種VEGFR-2在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑。

Western Blot中文一般稱為蛋白質(zhì)印跡，它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。

本實(shí)驗(yàn)顯示：當(dāng)同一時(shí)間點(diǎn)不同濃度比較時(shí)，各濃度組細(xì)胞P-VEGFR-2、P-VEGFR-3的表達(dá)有明顯的差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。索拉非尼的濃度越大，P-VEGFR-2、P-VEGFR-3的表達(dá)越少，提示呈現(xiàn)濃度依賴性。提示索拉非尼能夠抑制P-VEGFR-2、P-VEGFR-3的表達(dá)。關(guān)于索拉非尼對(duì)肺癌細(xì)胞株A549中P-VEGFR-2、P-VEGFR-3的表達(dá)的影響，國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道：在同一時(shí)間點(diǎn)不同濃度組索拉非尼能夠抑制肺癌細(xì)胞株A549中P-VEGFR-2的表達(dá)，并呈濃度依賴性[7]。與本實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)果一致。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)索拉非尼能夠抑制人肺癌細(xì)胞株A549中P-VEGFR-3的表達(dá)，同樣呈濃度依賴性。

另外本實(shí)驗(yàn)顯示：在同一濃度組不同時(shí)間點(diǎn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這與MTT的結(jié)果（索拉非尼能夠抑制人肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)，呈現(xiàn)一定的時(shí)間和濃度依賴性）不一致。說(shuō)明索拉非尼對(duì)于人肺癌細(xì)胞A549可能還存在著其它的靶點(diǎn)。

總之，索拉非尼能夠抑制人肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)，其機(jī)制并不是通過(guò)直接抑制VEGFR-2和VEGFR-3的表達(dá)，而是可能通過(guò)抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上游分子VEGFR-2和VEGFR-3的磷酸化水平，以阻止腫瘤血管生成，從而起到抗腫瘤作用，這就為索拉非尼用于肺癌提供了理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)是體外實(shí)驗(yàn)，腫瘤細(xì)胞脫離體內(nèi)生長(zhǎng)內(nèi)環(huán)境會(huì)受外界多種因素影響；藥物在體內(nèi)作用比在體外實(shí)驗(yàn)中要復(fù)雜，索拉非尼在不同藥物濃度/時(shí)間下對(duì)體外細(xì)胞毒作用只是體內(nèi)殺傷作用的相對(duì)反映，而且受實(shí)驗(yàn)條件限制，結(jié)果有一定局限性；另外本實(shí)驗(yàn)選取單一肺癌細(xì)胞、單一藥物索拉非尼，對(duì)于此實(shí)驗(yàn)還有繼續(xù)探討的空間。因此，關(guān)于索拉非尼對(duì)肺癌的作用機(jī)制，我們還要大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)繼續(xù)深入的研究以便為臨床應(yīng)用提供充足的理論依據(jù)。

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收稿日期：2018-6-7；修回日期：2018-6-22

編輯/楊倩