蔣烈浩　譚卓　殷珂欣　黃煜慶　溫慶良　朱欣　葛明華

【摘要】 目的：初步探討DEAR1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）中的表達情況及其臨床意義。方法：采用免疫組化檢測60例甲狀腺乳頭狀癌組織及對應癌旁組織中DEAR1蛋白的表達情況，分析DEAR1表達與臨床病理因素之間的相關(guān)性。結(jié)果：DEAR1蛋白在PTC組織中表達量顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。DEAR1蛋白低表達與PTC腫瘤直徑較大、包膜侵犯和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（ρ=-0.367、-0.436、-0.406，P=0.004、0.002、0.001），而與性別、年齡、腺內(nèi)播散、砂粒體、腫瘤數(shù)量組均無明顯相關(guān)性（P>0.05）。結(jié)論：DEAR1蛋白表達缺失與PTC的發(fā)生、發(fā)展可能存在密切聯(lián)系，且在PTC增殖、包膜侵犯和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮著一定的作用。

【關(guān)鍵詞】 DEAR1蛋白； 甲狀腺乳頭狀癌； 免疫組化； 侵襲； 轉(zhuǎn)移

Expression and Clinical Significance of DEAR1 Protein in Papillary Thyroid Carcinoma/JIANG Liehao，TAN Zhuo，YIN Kexin，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（26）：005-009

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of DEAR1 in papillary thyroid carcinoma（PTC）and its para-carcinoma tissues and evaluate the association between DEAR1 expression and clinicopathologic factors.Method：Immunohistochemistry was used to evaluate the expression of DEAR1 in 60 cases of PTC and para-carcinoma tissues and the relationship between DEAR1 expression and clinicopathologic factors were analyzed.Result：The expression of DEAR1 was significantly down-regulated in PTC tissues compared to para-carcinoma tissues （P<0.01）.The expression of DEAR1 was significantly associated with tumor size，Capsular invasion and Lymph node metastasis（ρ=-0.367，-0.436，-0.406，P=0.004，0.002，0.001），while no significant relationship were found between the expression of DEAR1 and gender，age，lobe dissemination，psammoma body and tumor number（P>0.05）.Conclusion：The low expression of DEAR1 may relate to the development of PTC，and it may play an important role in proliferation，capsular invasion and Lymph node metastasis of papillary thyroid carcinoma.

【Key words】 DEAR1 protein； Papillary thyroid carcinoma； Immunohistochemistry； Invasion； Metastasis

First-authors address：Zhejiang Cancer Hospital，Hangzhou 310022，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.26.002

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌腫瘤，近年來甲狀腺癌的發(fā)病率快速上升，已被列入惡性腫瘤的前10位[1]。根據(jù)2016年美國國家癌癥署數(shù)據(jù)顯示，全世界新發(fā)的甲狀腺癌以平均每年大于5%的速度遞增，其中增長最快的是甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[2]。雖然絕大多數(shù)PTC預后優(yōu)異，10年生存率可達90%以上，但約有50%的患者在發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)存在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，有10%～20%的病例會出現(xiàn)反復發(fā)作及遠處轉(zhuǎn)移，一旦發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，10年生存率降至40%左右[3]。目前，臨床上對于PTC的主要治療方式是手術(shù)切除，放化療基本無效[4]。但是，近幾年來學術(shù)界對于PTC是否需要手術(shù)一直存在爭議，部分專家認為PTC惡性程度低，進展緩慢，對于直徑小于1 cm的PTC可暫時予以隨訪觀察[5]。而另一部分支持手術(shù)的專家則認為微小癌不一定等于低危癌，在臨床中很多微小癌患者的進展非?？?，在早期就出現(xiàn)局部或遠處轉(zhuǎn)移，故而在目前缺乏有效鑒別手段的情況下，PTC的早診早治還是十分有必要的。但是，目前導致PTC發(fā)病和進展的詳細分子機制仍未被完全闡明。因此研究高危型PTC的重要分子事件，篩選用于表征高危型PTC惡性演進及轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標志物，進而早期從眾多PTC患者中鑒別出高危型患者，實現(xiàn)有效早期診斷和預后預測，對患者進行分層治療，具有重要的理論意義和臨床應用價值。

DEAR1（ductal epithelium-associated ring chromosome 1）基因位于1號染色體p35.1，有研究表明該區(qū)域的雜合性缺失可能與乳腺癌等多種上皮惡性腫瘤密切相關(guān)[6]。近年來，已有報道顯示DEAR1可以顯著地影響腫瘤細胞的極性及細胞骨架結(jié)構(gòu)，在乳腺癌、肺癌、急性髓細胞性白血病等多種惡性腫瘤中發(fā)揮著抑癌基因的作用[7-9]。但DEAR1在PTC中的作用尚未見報道。本研究擬通過免疫組化方法檢測PTC組織中DEAR1蛋白的表達情況，進一步探討DEAR1與PTC臨床病理因素相關(guān)性。希望能初步闡明DEAR1基因在PTC發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，以期為今后高危型PTC患者的篩查和危險分層診治提供一定的分子研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究入組60例2014年11月-2015年1月在本院首診的PTC患者，收集其甲狀腺乳頭狀癌及對應癌旁組織標本。本研究經(jīng)浙江省腫瘤醫(yī)院倫理審核批準，所有患者術(shù)前均簽署知情同意，術(shù)后均經(jīng)病理診斷確診為甲狀腺乳頭狀癌。所有組織標本在手術(shù)切除離體后立即由專業(yè)生物樣本庫人員切取并置入液氮冷凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃低溫冰箱保存。本研究所有患者病例資料完整，術(shù)前均未行放化療及其他特殊治療。本研究排除有其他并發(fā)惡性腫瘤，或有嚴重肝、腎、心血管功能障礙及嚴重并發(fā)癥的病例。

1.2 試劑 DAB顯色試劑盒（中國索萊寶科技有限公司）；改良型蘇木素染色液（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Anti-DEAR1抗體（英國Abcam公司），HRP標記羊抗兔二抗（免疫組化用）（英國Abcam公司）；一抗稀釋液（中國碧云天有限公司）；二抗稀釋液（中國碧云天有限公司）；檸檬酸鈉（中國致遠化學試劑有限公司）；PBS緩沖液（中國飛凈生物科技有限公司）；甲醛（中國常州恒光化學試劑有限公司）；無水乙醇（中國常州恒光化學試劑有限公司）；二甲苯（中國常州恒光化學試劑有限公司）；過氧化氫溶液（中國常州恒光化學試劑有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法 用甲醛固定所有手術(shù)標本，石蠟常規(guī)包埋，5 μm切片。乙醇梯度脫蠟、水化后將切片浸沒于檸檬酸鈉緩沖液中，微波抗原修復，每張切片滴2滴5%過氧化氫溶液，靜置5 min以清除內(nèi)源性過氧化物酶，加上適宜濃度（1︰200）的DEAR1一抗稀釋溶液100 μL，室溫孵育1 h。蒸餾水及PBS液沖洗后，加適宜濃度（1︰1 000）HRP標記羊抗兔二抗稀釋溶液100 μL，濕盒孵育

30 min。常規(guī)DAB顯色、蘇木素復染、促藍、乙醇梯度脫水后封片。

1.3.2 讀片打分 將切片置于顯微鏡（×400）下拍照，每張切片選取5個清晰、不重復、典型部位，若細胞核、細胞漿及細胞膜任何一處出現(xiàn)棕黃色顆粒時，評定為陽性細胞，評分標準采用半定量分析法：染色強度以多數(shù)細胞呈現(xiàn)的染色特性（染色深淺需與背景著色相對比）計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比即某類細胞5個視野（每×400高倍視野計數(shù)100個此類細胞）的陽性細胞平均數(shù)：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。所取每個視野均進行染色強度計分與陽性細胞百分比計分，染色強度與陽性細胞百分比的乘積：0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。所有的切片都經(jīng)3名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生獨立閱片，本研究定義最終得分≤4分為陰性，>4分為陽性。

1.4 觀察指標 完整搜集入組的60例患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、包膜累犯情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腺內(nèi)傳播情況、有無沙粒體等基本臨床病理信息，結(jié)合DEAR1在組織樣本中的表達情況，分析其與上述臨床病理特征之間的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗或Fisher確切概率法，相關(guān)性分析采用Spearman，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織中DEAR1蛋白表達情況 通過對所有樣本進行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)DEAR1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中低表達，而在癌旁組織中高表達，統(tǒng)計結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌組織中DEAR1蛋白陰性33例，陽性27例，癌旁組織中陰性4例，陽性56例，甲狀腺乳頭狀癌組織中表達量陰性顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（字2=32.862，P=0.000）。

2.2 DEAR1蛋白表達水平與PTC臨床病理特征之間的關(guān)系 結(jié)合60例PTC患者的臨床病理特征，進一步分析DEAR1蛋白表達水平與PTC臨床病理特征之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示：（1）在PTC直徑>1 cm組織中DEAR1蛋白陽性率為13.33%（2/15）明顯低于直徑≤1 cm組織，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；（2）伴包膜侵犯的PTC組織中DEAR1蛋白陽性率明顯低于無包膜侵犯的PTC組織，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；（3）伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組織中DEAR1蛋白陽性率明顯低于無包膜侵犯的PTC組織，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而不同性別、年齡、腺葉有無播散、有無砂粒體、腫瘤數(shù)量的DEAR1蛋白表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。（4）Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示：DEAR1蛋白低表達與PTC腫瘤直徑較大、包膜侵犯和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)

（ρ=-0.367、-0.436、-0.406，P=0.004、0.002、0.001），而與性別、年齡、腺內(nèi)播散、砂粒體、腫瘤數(shù)量均無明顯相關(guān)性（P>0.05）。

3 討論

近年來，PTC發(fā)病率在全球急速上升，雖然絕大多數(shù)PTC預后較良好，但仍有一部分患者早期便出現(xiàn)局部侵犯或遠處轉(zhuǎn)移，這也導致學術(shù)界對于PTC是否需要早期手術(shù)一直存在爭議[2，10]。目前已有部分報道顯示BRAF、TERT、PTEN、RunX2、S100A4、RAS、AKT1、ALK、RET、PAX8/PPARγ、galectin3等基因在PTC的局部侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至遠處轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮著一定的作用[11-14]。BRAFV600E突變一度被認為是PTC中最經(jīng)典的基因突變，與PTC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復發(fā)以及對腺外組織的侵犯有一定的相關(guān)性[15]。雖然其中的部分標記物曾被嘗試用于甲狀腺癌的輔助診斷，但至今仍無有效突破，能真正用于臨床檢測的分子標志物仍然十分缺乏，使得目前在術(shù)前對PTC患者進行危險分層診治仍然存在較大的困難。故而積極尋求甲狀腺乳頭狀癌的特異性標志物，對于PTC的早期診療及預后判斷意義重大。

DEAR1（TRIM62）蛋白是TRIM（Tripartite Motif）家族的一員，內(nèi)具RING、B-box、Coiled-Coiled三個結(jié)構(gòu)域，在蛋白復合體組裝、空間結(jié)構(gòu)維持及部分蛋白質(zhì)的泛素化降解過程中都發(fā)揮著重要的作用。近年來，DEAR1被發(fā)現(xiàn)在正常上皮細胞中高表達，在乳腺癌、肺癌、腎癌等多種惡性腫瘤中存在突變及表達減少[7-9，16]。研究發(fā)現(xiàn)在K-Ras突變的肺癌小鼠模型中敲除DEAR1，能協(xié)同K-Ras突變，共同促進腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，該結(jié)果表明DEAR1表達下調(diào)可能在肺癌的進展中發(fā)揮著重要作用[7]。文獻[8]報道顯示，DEAR1在急性髓細胞性白血病腫瘤細胞中的表達量明顯低于正常對照細胞，DEAR1表達缺失可能參與了白血病的發(fā)生，且是急性髓細胞性白血病預后不良的獨立危險因素。在乳腺癌細胞系中穩(wěn)定轉(zhuǎn)入野生型DEAR1表達后，在3D培養(yǎng)模型中可以觀察到規(guī)則的乳腺腺泡重建，細胞極性恢復；相反，如果沉默DEAR1表達會發(fā)現(xiàn)細胞極性消失，腺泡結(jié)構(gòu)紊亂，甚至消失[9]，這表明DEAR1在乳腺癌中可以通過調(diào)節(jié)細胞極性，進而發(fā)揮腫瘤抑制作用。以上研究表明DEAR1可能通過影響腫瘤細胞的極性及細胞骨架結(jié)構(gòu)，進而調(diào)節(jié)腫瘤組織結(jié)構(gòu)，在腫瘤中發(fā)揮著抑癌基因的作用[7]。

目前已有研究顯示細胞極性的喪失能夠與其他致癌信號通路協(xié)同作用，誘導上皮細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[17-19]。EMT過程已經(jīng)被證實在乳腺癌、胃癌等多種上皮性惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，且該過程可能受TGF-β信號通路的調(diào)節(jié)[20]。目前，已有研究顯示DEAR1在TGF-β信號通路的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，在乳腺癌中野生型DEAR1表達可誘導SMAD3被泛素化降解，進而使TGF-β誘導的EMT過程被抑制；反之，敲除DEAR1表達后將導致SMAD3表達上調(diào)，進而激活TGF-β誘導的磷酸化和核翻譯，并促進EMT過程[6]。這表明DEAR1可能通過抑制TGF-β信號通路來發(fā)揮其腫瘤抑制基因的作用。

本實驗以前期的研究成果為基礎(chǔ)，已成功篩選出甲狀腺乳頭狀癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異基因表達譜，采用生物信息方法，結(jié)合免疫組化方法確定了DEAR1為候選研究對象，目前為止，關(guān)于DEAR1基因在甲狀腺癌中的具體生物學功能尚未見報道。

本研究主要通過免疫組化法檢測了DEAR1蛋白在60例PTC及癌旁組織中的表達情況，并進一步分析了DEAR1蛋白的表達水平與PTC臨床病理因素之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示：DEAR1蛋白在PTC組織中的表達量顯著低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。繼而通過與上述標本臨床病理數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，DEAR1蛋白的表達水平與腫瘤大小、包膜侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.01），而與性別、年齡、有無腺內(nèi)播散、有無砂粒體、腫瘤數(shù)量無明顯相關(guān)性（P>0.05）。這一結(jié)果提示DEAR1基因表達缺失可能在PTC的發(fā)生發(fā)展、局部侵犯及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。但目前為止筆者僅僅研究了DEAR1在PTC腫瘤組織及其對應的癌旁正常組織中的表達情況及其與各臨床病理因素之間的相關(guān)性，其抑制PTC侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機制實驗正在研究中，將在后續(xù)報道中繼續(xù)完善。

綜上所述，DEAR1基因表達缺失在PTC發(fā)生發(fā)展的過程中可能發(fā)揮著一定的作用，且與PTC的腫瘤大小、包膜侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，DEAR1基因?qū)砜赡転镻TC高危患者的早期篩查、診治提供新的分子標記物或藥物干預靶點，并有望為PTC患者的分層診斷及精準治療奠定一定的理論基礎(chǔ)與實驗依據(jù)。

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（收稿日期：2018-04-08） （本文編輯：張爽）