蔣烈浩　譚卓　殷珂欣　黃煜慶　溫慶良　朱欣　葛明華

【摘要】 目的：初步探討DEAR1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）中的表達(dá)情況及其臨床意義。方法：采用免疫組化檢測(cè)60例甲狀腺乳頭狀癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中DEAR1蛋白的表達(dá)情況，分析DEAR1表達(dá)與臨床病理因素之間的相關(guān)性。結(jié)果：DEAR1蛋白在PTC組織中表達(dá)量顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。DEAR1蛋白低表達(dá)與PTC腫瘤直徑較大、包膜侵犯和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（ρ=-0.367、-0.436、-0.406，P=0.004、0.002、0.001），而與性別、年齡、腺內(nèi)播散、砂粒體、腫瘤數(shù)量組均無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。結(jié)論：DEAR1蛋白表達(dá)缺失與PTC的發(fā)生、發(fā)展可能存在密切聯(lián)系，且在PTC增殖、包膜侵犯和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮著一定的作用。

【關(guān)鍵詞】 DEAR1蛋白； 甲狀腺乳頭狀癌； 免疫組化； 侵襲； 轉(zhuǎn)移

Expression and Clinical Significance of DEAR1 Protein in Papillary Thyroid Carcinoma/JIANG Liehao，TAN Zhuo，YIN Kexin，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（26）：005-009

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of DEAR1 in papillary thyroid carcinoma（PTC）and its para-carcinoma tissues and evaluate the association between DEAR1 expression and clinicopathologic factors.Method：Immunohistochemistry was used to evaluate the expression of DEAR1 in 60 cases of PTC and para-carcinoma tissues and the relationship between DEAR1 expression and clinicopathologic factors were analyzed.Result：The expression of DEAR1 was significantly down-regulated in PTC tissues compared to para-carcinoma tissues （P<0.01）.The expression of DEAR1 was significantly associated with tumor size，Capsular invasion and Lymph node metastasis（ρ=-0.367，-0.436，-0.406，P=0.004，0.002，0.001），while no significant relationship were found between the expression of DEAR1 and gender，age，lobe dissemination，psammoma body and tumor number（P>0.05）.Conclusion：The low expression of DEAR1 may relate to the development of PTC，and it may play an important role in proliferation，capsular invasion and Lymph node metastasis of papillary thyroid carcinoma.

【Key words】 DEAR1 protein； Papillary thyroid carcinoma； Immunohistochemistry； Invasion； Metastasis

First-authors address：Zhejiang Cancer Hospital，Hangzhou 310022，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.26.002

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌腫瘤，近年來(lái)甲狀腺癌的發(fā)病率快速上升，已被列入惡性腫瘤的前10位[1]。根據(jù)2016年美國(guó)國(guó)家癌癥署數(shù)據(jù)顯示，全世界新發(fā)的甲狀腺癌以平均每年大于5%的速度遞增，其中增長(zhǎng)最快的是甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[2]。雖然絕大多數(shù)PTC預(yù)后優(yōu)異，10年生存率可達(dá)90%以上，但約有50%的患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)存在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，有10%～20%的病例會(huì)出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，一旦發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，10年生存率降至40%左右[3]。目前，臨床上對(duì)于PTC的主要治療方式是手術(shù)切除，放化療基本無(wú)效[4]。但是，近幾年來(lái)學(xué)術(shù)界對(duì)于PTC是否需要手術(shù)一直存在爭(zhēng)議，部分專家認(rèn)為PTC惡性程度低，進(jìn)展緩慢，對(duì)于直徑小于1 cm的PTC可暫時(shí)予以隨訪觀察[5]。而另一部分支持手術(shù)的專家則認(rèn)為微小癌不一定等于低危癌，在臨床中很多微小癌患者的進(jìn)展非?？?，在早期就出現(xiàn)局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，故而在目前缺乏有效鑒別手段的情況下，PTC的早診早治還是十分有必要的。但是，目前導(dǎo)致PTC發(fā)病和進(jìn)展的詳細(xì)分子機(jī)制仍未被完全闡明。因此研究高危型PTC的重要分子事件，篩選用于表征高危型PTC惡性演進(jìn)及轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)志物，進(jìn)而早期從眾多PTC患者中鑒別出高危型患者，實(shí)現(xiàn)有效早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)，對(duì)患者進(jìn)行分層治療，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。

DEAR1（ductal epithelium-associated ring chromosome 1）基因位于1號(hào)染色體p35.1，有研究表明該區(qū)域的雜合性缺失可能與乳腺癌等多種上皮惡性腫瘤密切相關(guān)[6]。近年來(lái)，已有報(bào)道顯示DEAR1可以顯著地影響腫瘤細(xì)胞的極性及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，在乳腺癌、肺癌、急性髓細(xì)胞性白血病等多種惡性腫瘤中發(fā)揮著抑癌基因的作用[7-9]。但DEAR1在PTC中的作用尚未見報(bào)道。本研究擬通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)PTC組織中DEAR1蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討DEAR1與PTC臨床病理因素相關(guān)性。希望能初步闡明DEAR1基因在PTC發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，以期為今后高危型PTC患者的篩查和危險(xiǎn)分層診治提供一定的分子研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究入組60例2014年11月-2015年1月在本院首診的PTC患者，收集其甲狀腺乳頭狀癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本。本研究經(jīng)浙江省腫瘤醫(yī)院倫理審核批準(zhǔn)，所有患者術(shù)前均簽署知情同意，術(shù)后均經(jīng)病理診斷確診為甲狀腺乳頭狀癌。所有組織標(biāo)本在手術(shù)切除離體后立即由專業(yè)生物樣本庫(kù)人員切取并置入液氮冷凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃低溫冰箱保存。本研究所有患者病例資料完整，術(shù)前均未行放化療及其他特殊治療。本研究排除有其他并發(fā)惡性腫瘤，或有嚴(yán)重肝、腎、心血管功能障礙及嚴(yán)重并發(fā)癥的病例。

1.2 試劑 DAB顯色試劑盒（中國(guó)索萊寶科技有限公司）；改良型蘇木素染色液（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Anti-DEAR1抗體（英國(guó)Abcam公司），HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（免疫組化用）（英國(guó)Abcam公司）；一抗稀釋液（中國(guó)碧云天有限公司）；二抗稀釋液（中國(guó)碧云天有限公司）；檸檬酸鈉（中國(guó)致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；PBS緩沖液（中國(guó)飛凈生物科技有限公司）；甲醛（中國(guó)常州恒光化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇（中國(guó)常州恒光化學(xué)試劑有限公司）；二甲苯（中國(guó)常州恒光化學(xué)試劑有限公司）；過(guò)氧化氫溶液（中國(guó)常州恒光化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法 用甲醛固定所有手術(shù)標(biāo)本，石蠟常規(guī)包埋，5 μm切片。乙醇梯度脫蠟、水化后將切片浸沒(méi)于檸檬酸鈉緩沖液中，微波抗原修復(fù)，每張切片滴2滴5%過(guò)氧化氫溶液，靜置5 min以清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加上適宜濃度（1︰200）的DEAR1一抗稀釋溶液100 μL，室溫孵育1 h。蒸餾水及PBS液沖洗后，加適宜濃度（1︰1 000）HRP標(biāo)記羊抗兔二抗稀釋溶液100 μL，濕盒孵育

30 min。常規(guī)DAB顯色、蘇木素復(fù)染、促藍(lán)、乙醇梯度脫水后封片。

1.3.2 讀片打分 將切片置于顯微鏡（×400）下拍照，每張切片選取5個(gè)清晰、不重復(fù)、典型部位，若細(xì)胞核、細(xì)胞漿及細(xì)胞膜任何一處出現(xiàn)棕黃色顆粒時(shí)，評(píng)定為陽(yáng)性細(xì)胞，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用半定量分析法：染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特性（染色深淺需與背景著色相對(duì)比）計(jì)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比即某類細(xì)胞5個(gè)視野（每×400高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)此類細(xì)胞）的陽(yáng)性細(xì)胞平均數(shù)：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。所取每個(gè)視野均進(jìn)行染色強(qiáng)度計(jì)分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分，染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積：0分為陰性（-），1～4分為弱陽(yáng)性（+），5～8分為中度陽(yáng)性（++），9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。所有的切片都經(jīng)3名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生獨(dú)立閱片，本研究定義最終得分≤4分為陰性，>4分為陽(yáng)性。

1.4 觀察指標(biāo) 完整搜集入組的60例患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、包膜累犯情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腺內(nèi)傳播情況、有無(wú)沙粒體等基本臨床病理信息，結(jié)合DEAR1在組織樣本中的表達(dá)情況，分析其與上述臨床病理特征之間的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，相關(guān)性分析采用Spearman，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織中DEAR1蛋白表達(dá)情況 通過(guò)對(duì)所有樣本進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)DEAR1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中低表達(dá)，而在癌旁組織中高表達(dá)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌組織中DEAR1蛋白陰性33例，陽(yáng)性27例，癌旁組織中陰性4例，陽(yáng)性56例，甲狀腺乳頭狀癌組織中表達(dá)量陰性顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=32.862，P=0.000）。

2.2 DEAR1蛋白表達(dá)水平與PTC臨床病理特征之間的關(guān)系 結(jié)合60例PTC患者的臨床病理特征，進(jìn)一步分析DEAR1蛋白表達(dá)水平與PTC臨床病理特征之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示：（1）在PTC直徑>1 cm組織中DEAR1蛋白陽(yáng)性率為13.33%（2/15）明顯低于直徑≤1 cm組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；（2）伴包膜侵犯的PTC組織中DEAR1蛋白陽(yáng)性率明顯低于無(wú)包膜侵犯的PTC組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；（3）伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組織中DEAR1蛋白陽(yáng)性率明顯低于無(wú)包膜侵犯的PTC組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而不同性別、年齡、腺葉有無(wú)播散、有無(wú)砂粒體、腫瘤數(shù)量的DEAR1蛋白表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。（4）Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示：DEAR1蛋白低表達(dá)與PTC腫瘤直徑較大、包膜侵犯和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)

（ρ=-0.367、-0.436、-0.406，P=0.004、0.002、0.001），而與性別、年齡、腺內(nèi)播散、砂粒體、腫瘤數(shù)量均無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。

3 討論

近年來(lái)，PTC發(fā)病率在全球急速上升，雖然絕大多數(shù)PTC預(yù)后較良好，但仍有一部分患者早期便出現(xiàn)局部侵犯或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這也導(dǎo)致學(xué)術(shù)界對(duì)于PTC是否需要早期手術(shù)一直存在爭(zhēng)議[2，10]。目前已有部分報(bào)道顯示BRAF、TERT、PTEN、RunX2、S100A4、RAS、AKT1、ALK、RET、PAX8/PPARγ、galectin3等基因在PTC的局部侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用[11-14]。BRAFV600E突變一度被認(rèn)為是PTC中最經(jīng)典的基因突變，與PTC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及對(duì)腺外組織的侵犯有一定的相關(guān)性[15]。雖然其中的部分標(biāo)記物曾被嘗試用于甲狀腺癌的輔助診斷，但至今仍無(wú)有效突破，能真正用于臨床檢測(cè)的分子標(biāo)志物仍然十分缺乏，使得目前在術(shù)前對(duì)PTC患者進(jìn)行危險(xiǎn)分層診治仍然存在較大的困難。故而積極尋求甲狀腺乳頭狀癌的特異性標(biāo)志物，對(duì)于PTC的早期診療及預(yù)后判斷意義重大。

DEAR1（TRIM62）蛋白是TRIM（Tripartite Motif）家族的一員，內(nèi)具RING、B-box、Coiled-Coiled三個(gè)結(jié)構(gòu)域，在蛋白復(fù)合體組裝、空間結(jié)構(gòu)維持及部分蛋白質(zhì)的泛素化降解過(guò)程中都發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái)，DEAR1被發(fā)現(xiàn)在正常上皮細(xì)胞中高表達(dá)，在乳腺癌、肺癌、腎癌等多種惡性腫瘤中存在突變及表達(dá)減少[7-9，16]。研究發(fā)現(xiàn)在K-Ras突變的肺癌小鼠模型中敲除DEAR1，能協(xié)同K-Ras突變，共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，該結(jié)果表明DEAR1表達(dá)下調(diào)可能在肺癌的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[7]。文獻(xiàn)[8]報(bào)道顯示，DEAR1在急性髓細(xì)胞性白血病腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量明顯低于正常對(duì)照細(xì)胞，DEAR1表達(dá)缺失可能參與了白血病的發(fā)生，且是急性髓細(xì)胞性白血病預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在乳腺癌細(xì)胞系中穩(wěn)定轉(zhuǎn)入野生型DEAR1表達(dá)后，在3D培養(yǎng)模型中可以觀察到規(guī)則的乳腺腺泡重建，細(xì)胞極性恢復(fù)；相反，如果沉默DEAR1表達(dá)會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞極性消失，腺泡結(jié)構(gòu)紊亂，甚至消失[9]，這表明DEAR1在乳腺癌中可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞極性，進(jìn)而發(fā)揮腫瘤抑制作用。以上研究表明DEAR1可能通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的極性及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤組織結(jié)構(gòu)，在腫瘤中發(fā)揮著抑癌基因的作用[7]。

目前已有研究顯示細(xì)胞極性的喪失能夠與其他致癌信號(hào)通路協(xié)同作用，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[17-19]。EMT過(guò)程已經(jīng)被證實(shí)在乳腺癌、胃癌等多種上皮性惡性腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，且該過(guò)程可能受TGF-β信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[20]。目前，已有研究顯示DEAR1在TGF-β信號(hào)通路的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，在乳腺癌中野生型DEAR1表達(dá)可誘導(dǎo)SMAD3被泛素化降解，進(jìn)而使TGF-β誘導(dǎo)的EMT過(guò)程被抑制；反之，敲除DEAR1表達(dá)后將導(dǎo)致SMAD3表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而激活TGF-β誘導(dǎo)的磷酸化和核翻譯，并促進(jìn)EMT過(guò)程[6]。這表明DEAR1可能通過(guò)抑制TGF-β信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮其腫瘤抑制基因的作用。

本實(shí)驗(yàn)以前期的研究成果為基礎(chǔ)，已成功篩選出甲狀腺乳頭狀癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異基因表達(dá)譜，采用生物信息方法，結(jié)合免疫組化方法確定了DEAR1為候選研究對(duì)象，目前為止，關(guān)于DEAR1基因在甲狀腺癌中的具體生物學(xué)功能尚未見報(bào)道。

本研究主要通過(guò)免疫組化法檢測(cè)了DEAR1蛋白在60例PTC及癌旁組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析了DEAR1蛋白的表達(dá)水平與PTC臨床病理因素之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示：DEAR1蛋白在PTC組織中的表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。繼而通過(guò)與上述標(biāo)本臨床病理數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，DEAR1蛋白的表達(dá)水平與腫瘤大小、包膜侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.01），而與性別、年齡、有無(wú)腺內(nèi)播散、有無(wú)砂粒體、腫瘤數(shù)量無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。這一結(jié)果提示DEAR1基因表達(dá)缺失可能在PTC的發(fā)生發(fā)展、局部侵犯及轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。但目前為止筆者僅僅研究了DEAR1在PTC腫瘤組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中的表達(dá)情況及其與各臨床病理因素之間的相關(guān)性，其抑制PTC侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)正在研究中，將在后續(xù)報(bào)道中繼續(xù)完善。

綜上所述，DEAR1基因表達(dá)缺失在PTC發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中可能發(fā)揮著一定的作用，且與PTC的腫瘤大小、包膜侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，DEAR1基因?qū)?lái)可能為PTC高?；颊叩脑缙诤Y查、診治提供新的分子標(biāo)記物或藥物干預(yù)靶點(diǎn)，并有望為PTC患者的分層診斷及精準(zhǔn)治療奠定一定的理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2018-04-08） （本文編輯：張爽）