王 崢 秦 源

WANG Zhen QIN Yuan

(湖南科技學院化學與生物工程學院，湖南 永州 425199)

(Department of Biological and Chemical Engineering, Hunan University of Science and Engineering, Yongzhou, Hunan 425199, China)

槐樹自古以來就是中國藥史上重要的藥食同源植物，有“金藥樹”之稱。根據花色，槐樹可分為白、青、黃、金槐等4個類別。其中，金槐為綠色落葉喬木，開花期長，是槐樹中的優(yōu)良品種，廣泛分布于廣西全州以及湖南永州、衡陽一帶?；泵诪槎箍浦参锘?Sophora japonica L.)的干燥花蕾及花[1]354，已經被列在國家衛(wèi)生部第一批藥食同源名單中[2]。蘆丁(Rutin)別名蕓香苷，是槐米總黃酮中的主要活性成分，分子中含有許多酚羥基，為黃酮苷類化合物，是一種生物活性很強，廣泛應用的臨床中藥，具有防止小血板聚集或抑制血栓形成，促進細胞增生和具有抗炎、降血脂的等作用[3-4]。

槐米中蘆丁含量的高低是決定槐米品質的重要指標，也直接關系到槐米生產的經濟效益。據文獻[5]研究結果顯示，金槐中蘆丁的含量可達25% 左右，遠遠高于其他3種。前人[6-7]對槐米蘆丁的純化方法主要有結晶法和大孔樹脂。結晶法存在耗時久，溶劑不環(huán)保的缺陷，而大孔樹脂純化法對蘆丁純化的效率較低，難以達到藥典要求。據相關研究[8-9]，聚酰胺樹脂可與黃酮類、酚類等富含酚羥基的化合物形成氫鍵而被吸附，故本試驗擬采用聚酰胺樹脂層析法，結合高效液相法檢測，優(yōu)選出蘆丁最佳精制工藝路線，以期得到一種原料利用率高、工藝簡單且成本低的金槐精制蘆丁的方法，為槐米資源的產業(yè)化開發(fā)與綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金槐槐米：2016年產，永州錦溁金槐種植農業(yè)合作社。對其進行除雜45 ℃烘干后，粉粹，過40目篩，置自封袋中備用。粗品蘆丁(59.15%)以金槐槐米為原材料，實驗室前期用酸提堿沉的方法提取得到[10]。

1.2 主要試劑

蘆丁標準品：純度99%，中國食品藥品檢定研究院；

甲醇：色譜純，天津市福晨化學試劑廠；

冰醋酸、純化水、甲醇、乙醇、氫氧化鈣、硼砂等：分析純，天津市福晨化學試劑廠；

層析聚酰胺樹脂：650型，山東西亞化學股份有限公司。

1.3 儀器設備

回流提取器：FVSY-360型，北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司；

電子分析天平：JA3003型，上海舜宇恒平科學有限公司；

電熱鼓風干燥箱：WG-71型，天津市泰斯特儀器有限公司；

旋轉蒸發(fā)儀：RE-2000B型，鞏義市英峪高科儀器廠；

搖床：ZHWY-211B型，上海智城分析儀器制造有限公司；

高速多功能粉碎機：XY-100型，浙江省永康市松青五金廠；

高效液相色譜儀：LC-20AT型，日本島津公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 聚酰胺樹脂的預處理 將聚酰胺樹脂用95%乙醇浸泡3 d，不斷攪拌、適時振蕩，使其充分溶脹，除去氣泡及乙醇漂浮物后濕法裝入32 mm×490 mm層析柱中。繼用3倍體積95%的乙醇洗脫，洗至洗脫液透明并在蒸干后無殘渣或極少殘渣為止。再依次用3倍5%的NaOH水溶液沖洗、然后用蒸餾水洗至中性，其次用3倍體積4%的醋酸水溶液洗脫，最后再用蒸餾水洗脫至中性無醇味，備用[1]355。

1.4.2 蘆丁含量的測定 采用高效液相色譜法[1]355。色譜條件：色譜柱為CLC-BDS-C18(6.0 mm×150 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.1%醋酸溶液(42∶58)；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測器UV；檢測波長257 nm；進樣量10 μL；標準品為蘆丁(1 mg/mL)。

1.4.3 標準品溶液的制備 精密稱定蘆丁對照品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加少量甲醇溶解，繼續(xù)加甲醇至刻度并搖勻，即得蘆丁標準溶液。

1.4.4 標準曲線的繪制 取2.3標準品溶液，分別進樣2，4，6，8，10 μL。以進樣量(μL)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標繪制標準曲線，并進行線性回歸擬合，得線性回歸方程。

1.4.5 粗蘆丁的提取 準確稱取槐米粉末若干克，置于圓底燒瓶中，加入適量3%硼砂水，用飽和Ca(OH)2調節(jié)至pH為10，以液料比1∶16 (g/mL)回流微沸提取36 min，回流2次。合并提取液，溫度降到60 ℃左右用1 mol/L的HCl調節(jié)pH至2.5，放置12 h，抽濾、干燥得蘆丁粗品，備用[8]。粗蘆丁純度經高效液相測定含量為59.15%。

1.4.6 靜態(tài)試驗

(1) 靜態(tài)吸附與解吸附試驗：精確稱取預處理好的3種不同目數的(30～60，60～100，100～200目)聚酰胺樹脂各5.000 0 g (干重)，分別置于250 mL三角燒瓶中，加入50 mL 的樣品蘆丁提取液，使溶液濃度為5 mg/mL， 于搖床上振蕩24 h，充分吸附后，吸取濾液1.0 mL，用高效液相測其在257 nm 下的峰面積A，代入標準曲線回歸方程中，測定吸附后的濾液蘆丁的質量濃度。用去離子水將濾出的聚酰胺樹脂表面的殘留提取液洗去，然后分別另置于250 mL三角燒瓶中，加入70%的乙醇50 mL，置搖床中振蕩24 h，待充分解吸后立刻過濾，同法測其質量濃度。計算3種不同目數的聚酰胺樹脂對金槐蘆丁的靜態(tài)吸附量、解吸率。

(2) 靜態(tài)吸附與解吸附動力學：精確稱取處理好的3種不同目數(30～60，60～100，100～200目)聚酰胺樹脂各5.000 0 g(干重)，分別置于250 mL三角燒瓶中，精密加入50 mL 提取液，使溶液濃度為5 mg/mL，置搖床上振蕩，每隔30 min 取上清液1.0 mL，并測定其蘆丁濃度，繪制吸附動力學曲線。利用上述充分飽和吸附的樹脂，用蒸餾水沖洗其殘留的蘆丁提取液，加入體積分數70%乙醇溶液50 mL，置于搖床上振蕩，每隔30 min 取上清液1.0 mL 并測定其蘆丁濃度，繪制解吸附動力學曲線。

1.4.7 動態(tài)試驗

(1) 上樣濃度考察：精確稱取蘆丁粗品0.100 0 g，加50 mL 蒸餾水加熱使其充分溶解，均分5份，每份10 mL，再分別加蒸餾水50，60，70，80，90 mL得到不同質量濃度的樣品液，濃度分別為0.333，0.286，0.250，0.222，0.200 mg/mL。精確稱取5.000 0 g(干重)聚酰胺樹脂5份，濕法上柱，去離子水洗至無醇味?？刂茦悠芬毫魉贋?.0 mL/min，30 mL上樣。收集柱液，并測其蘆丁質量濃度，繪制吸附量與上樣濃度關系曲線，確定最佳上樣濃度。

(2) 上樣流速考察：精確稱取5.000 0 g(干重)聚酰胺樹脂5份，濕法上柱，去離子水洗至無醇味。用最佳上樣濃度上樣，樣品液30 mL過柱，控制流速分別為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL/min通過樹脂柱，收集流出的柱液，測其蘆丁質量濃度。繪制吸附量與上樣流速關系曲線，確定最佳上樣流速。

(3) 吸附泄露曲線：精確稱取5.000 0 g(干重)聚酰胺樹脂，濕法上柱，去離子水洗至無醇味。用確定的最佳上樣濃度和最佳上樣流速，每30 mL持續(xù)上樣，過柱。每10 mL(1 BV)收集為一管，測定其總蘆丁含量，并繪制吸附泄露曲線。

(4) 洗脫劑濃度考察：精確稱取5.000 0 g(干重)聚酰胺樹脂5份，濕法上柱，去離子水洗至無醇味。用最佳上樣濃度、上樣流速及30 mL過柱。待吸附完全飽和后，分別用50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液各30 mL 進行洗脫，收集洗脫液，測定解吸液中蘆丁質量濃度。

(5) 洗脫劑體積考察:精確稱取5.000 0 g(干重)聚酰胺樹脂5份，濕法上柱，去離子水洗至無醇味。樣品液按最佳條件上柱，待吸附完全后，用最佳洗脫劑進行洗脫，每5 mL(0.5 BV)收集一管，收集18管，并測定每管中蘆丁的質量濃度，繪制洗脫曲線，確定洗脫劑最佳用量。

1.4.8 驗證性實驗 精確稱取5.000 0 g(干重)聚酰胺樹脂，粗蘆丁提取液以最佳上樣濃度、上樣流速、上樣量上柱，流出的柱液再重新上柱一次，待充分吸附后，最后用最佳洗脫柱體積的最佳濃度洗脫液進行洗脫，并如此重復3次試驗。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

標準品與粗品的HPLC色譜圖見圖1、2。

由圖1、2可知，金槐槐米的蘆丁粗品與蘆丁標準品在同一時間出峰，且峰型較好，故可認為該峰是蘆丁的色譜峰。理論塔板數均>10 000，二者的分離度>1.5，符合藥典要求[1]355。粗品純度為59.15%。標準品線性回歸方程為：y=2 142 221x-61 283(R2=0.999 9)，結果表明，蘆丁在2～10 μg 內線性關系良好。

2.2 靜態(tài)試驗

3種樹脂的吸附量與解吸率見表1。

由表1可知，100～200目聚酰胺樹脂的吸附量為28.00 mg/g，解吸率為82.94%，較60～100與30～60目聚酰胺樹脂的都高。推測原因可能是不同目數的聚酰胺樹脂密度不同，與蘆丁的接觸面積不一樣，對蘆丁的吸附能力不同，解吸能力也不同[11-13]。綜上選取100～200目的聚酰胺樹脂進行后續(xù)研究。

圖1 蘆丁標準品的HPLC圖

圖2 蘆丁粗品的HPLC圖

Table1 Adsorption capacity and desorption of different kinds of polyamide resin

樹脂650型/目吸附量/(mg·g-1)解吸率/%30～6020.0449.1460～10022.1074.12100～20028.0082.94

工業(yè)實際生產中，生產效率與樹脂的動力學特性密切相關，適合的聚酰胺樹脂不僅要有較高的吸附量和解吸率，還要具備較快的吸附和解吸附速度[14-15]。

2.2.1 靜態(tài)吸附動力學結果分析 靜態(tài)吸附動力學曲線見圖3。

由圖3可知，30～60目的聚酰胺樹脂對蘆丁的吸附效果隨時間的變化不明顯，屬于慢速平衡型。60～100目和100～200目的聚酰胺樹脂均屬于快速平衡型，60～100目的聚酰胺樹脂在0.0～2.0 h階段，對蘆丁的吸附效果變化不明顯，而在2.0 h之后，吸附效果變化較為明顯；100～200目的聚酰胺樹脂對蘆丁的吸附效果隨著時間的變化顯著，比同時間下的60～100，30～60目聚酰胺樹脂的吸附速度都快，且吸附量也高，約3.0 h吸附完全。推測可能是100～200目的聚酰胺樹脂密度比30～60，60～100目的大，與蘆丁的接觸面積也相對較大，蘆丁又屬于黃酮苷類化合物，所含酚羥基較多，因而與之形成的氫鍵也較多，易被吸附。

圖3 靜態(tài)吸附動力曲線

2.2.2 靜態(tài)解吸附動力學結果分析 靜態(tài)解吸附動力學曲線見圖4。

圖4 靜態(tài)解吸動力曲線

由圖4可知，30～60目和60～100目聚酰胺樹脂隨時間的推移，解吸速度均變化不大，相對平穩(wěn)且解吸量不高。100～200目樹脂較其他2種樹脂解吸效果明顯，解吸量高，約3.0 h解吸完全。分析原因可能是不同吸附時間，不同吸附樹脂的飽和解吸量可能相同，物理化學性能不同，解吸動力學也有所差異[14-16]。綜上試驗結果，最終選擇100～200目聚酰胺樹脂對永州金槐中蘆丁進行后續(xù)動態(tài)吸附解吸性能研究。

2.3 動態(tài)試驗

2.3.1 上樣濃度的確定 由圖5可知，上樣濃度為0.200～0.286 mg/mL時，樹脂對蘆丁的吸附量呈上升趨勢；當上樣濃度為0.286 mg/mL時，吸附量達到最大，隨后樹脂對蘆丁的吸附量隨上樣濃度的上升呈下降趨勢?？赡苁菢悠芬簼舛冗^大，會在層析柱樹脂上端口沉積，導致部分樣品液不能被樹脂吸附分離；濃度過低，成分在樹脂中跑地較快，導致蘆丁成分來不及被吸附就已流出層析柱，從而影響純化效果準確性[17-19]。達到最大吸附量后又隨上樣濃度的上升而下降，這是由于上樣濃度過高，導致泄露點提前，吸附量下降。因此，上樣濃度控制在0.286 mg/mL。

圖5 上樣濃度對蘆丁吸附量的影響

2.3.2 上樣流速的確定 由圖6可知，隨著上樣流速的不同，聚酰胺樹脂對其的吸附程度有明顯區(qū)別。當上樣流速為4.0～1.0 mL/min 時，樹脂對蘆丁的吸附效果變化較大，當上樣流速為1.0 mL/min 之后，流出液中的蘆丁含量降低，幾乎接近于完全被吸附。蘆丁在1.0，0.5 mL/min吸附量相差不大，同時考慮到時間等控制，提高分離速率和生產效率，最終選1.0 mL/min作為最佳的上樣流速。

圖6 上樣流速對蘆丁吸附量的影響

2.3.3 吸附泄露曲線 當上樣量過載時，蘆丁出現泄漏[20]。由圖7可知，隨著粗蘆丁提取液上樣體積的增加，當收集到第11流份時，流出液中蘆丁的含量逐漸增加，說明樹脂對蘆丁的吸附開始出現泄漏。當收集到第14流份以后，流出液中總蘆丁的含量隨粗蘆丁提取液上樣體積的增加趨于平緩，說明此流份開始蘆丁已明顯泄露，并接近于飽和吸附，此時聚酰胺樹脂對蘆丁的飽和吸附量為28.00 mg/g。

2.3.4 洗脫劑濃度的確定 如圖8所示，聚酰胺樹脂對蘆丁的解吸量隨著乙醇濃度的升高先增長后降低，在80%以下解吸量隨著乙醇的濃度增加而增高，當乙醇體積分數達到80%以上時，樹脂對蘆丁的吸附量變化趨于平穩(wěn)?？赡苁腔泵字刑J丁在乙醇濃度為80%以下時溶解較少，因此解吸量較低；而隨著乙醇濃度>80%以后解吸量降低，可能是蘆丁溶液極性減小，蘆丁作為黃酮苷類化合物的溶解度反而降低。且從節(jié)省洗脫溶劑等方面考慮，選80%的乙醇作為洗脫溶劑。

圖7 吸附泄露曲線圖

圖8 乙醇體積分數對解吸量的影響

2.3.5 洗脫劑體積的確定 用洗脫劑對蘆丁進行洗脫解吸時，用量過少，被吸附成分洗脫不完全；用量過多，則會造成溶劑浪費，且對后續(xù)處理造成不便[20-23]。由圖9可知，聚酰胺樹脂對蘆丁的解吸量隨著洗脫體積的增加，呈先上升后下降的趨勢。當洗脫至第5流份后，樹脂對蘆丁的解吸量變化趨于平緩，表明此時蘆丁成分幾乎已被完全洗脫，以2個流份為1個柱體積，即以洗脫體積2.5 BV (柱體積)，可將絕大部分的蘆丁成分洗脫下來。因此，選擇2.5 BV為最佳洗脫體積。

綜合動態(tài)試驗結果可得出，聚酰胺樹脂純化金槐蘆丁的最佳工藝參數為：上樣濃度0.286 mg/mL、上樣流速1.0 mL/min、最大上樣量28.00 mg/g、洗脫劑為80%乙醇、洗脫劑用量2.5 BV。

圖9 金槐蘆丁洗脫曲線

2.4 驗證實驗

由表2可知，驗證實驗平均得率55%，純度均達99%以上，RSD<2%，說明該分離純化工藝可行。

表2 驗證實驗結果

3 結論

通過聚酰胺樹脂層析法對金槐蘆丁進行純化，靜態(tài)試驗結果表明，100～200目聚酰胺樹脂更適宜金槐蘆丁的純化，飽和吸附量為28.00 mg/g，解吸率為82.94%；動態(tài)試驗結果表明，聚酰胺法純化蘆丁的最佳工藝參數為：上樣濃度0.286 mg/mL，上樣流速1.0 mL/min，最大上樣量28.00 mg/g，洗脫劑為80%乙醇，洗脫劑用量2.5 BV。該工藝條件下蘆丁得率為55.49%，純度達到99%，且方法簡單，生產周期短，產品符合歐洲藥典要求，但工藝路線仍處于實驗階段，要進行工業(yè)生產仍需要進行放大試驗數據的探索。