白 龍邵 毅黃柳娟馮 博周昌艷索玉娟白亞龍林 淼

BAI Long1,2 SHAO Yi1,3 HUANG Liu-juan1 FENG Bo1 ZHOU Chang-yan1,3 SUO Yu-juan1 BAI Ya-long1 LIN Miao1

(1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海 201403；2. 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；3. 上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201403)

(1. Institute for Agri-Food Standards and Testing Technology, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China; 2. School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 3. Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology, Shanghai 201403, China)

四環(huán)素(tetracycline，tet)作為一種廣普類抗生素，在禽畜養(yǎng)殖場(chǎng)中被大量使用[1]，導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性[2]。研究表明，中國(guó)肉雞中多種致病菌對(duì)四環(huán)素類抗生素已經(jīng)產(chǎn)生了很高的耐藥性[3-5]。因此，禽源四環(huán)素耐藥菌的控制迫在眉睫。大量證據(jù)[6-8]表明，數(shù)量龐大的非致病菌可以是耐藥基因的供體、受體和中間體，因此，近年來(lái)，在全細(xì)菌范圍內(nèi)研究抗生素耐藥性的污染特征和耐藥基因的水平遷移規(guī)律，成為揭示耐藥性發(fā)生機(jī)制的新途徑[9]。然而，關(guān)于在整個(gè)細(xì)菌范圍內(nèi)進(jìn)行耐藥基因的篩查研究，現(xiàn)有試驗(yàn)[10-12]大多基于單重或不多于三重的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)而展開，工作量非常大。因此，亟需開發(fā)耐藥基因的快速篩查技術(shù)。

細(xì)菌對(duì)四環(huán)素的耐藥機(jī)理主要分為主動(dòng)外排蛋白(涉及的耐藥基因包括tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetZ、tetJ、tetK、tetL、tetV等)、核糖體保護(hù)蛋白(tetM、tetO、tetS、tetW、tetT)、滅活或鈍化四環(huán)素酶(tetX、tet34、tet37)[13]。其中tetA、tetD、tetG、tetS和tetX是雞肉中較多檢出的四環(huán)素耐藥基因[5]，且涉及了3種四環(huán)素耐藥機(jī)制。目前，對(duì)這5種四環(huán)素耐藥菌的多重PCR同時(shí)檢測(cè)技術(shù)尚未見報(bào)道。因此，本研究在已有的多重PCR技術(shù)開發(fā)經(jīng)驗(yàn)[14-16]基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度和退火溫度等因素，建立了同時(shí)檢測(cè)tetA、tetD、tetG、tetS和tetX的五重PCR體系，為禽源四環(huán)素耐藥基因的大規(guī)模篩查研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

四環(huán)素耐藥基因tetA、tetD、tetE、tetG、tetL、tetM、tetO、tetR、tetS、tetT和tetX，以及磺胺耐藥基因sul1和sul2片段的陽(yáng)性克?。罕緦?shí)驗(yàn)室克隆構(gòu)建并保存[17]；

禽源四環(huán)素耐藥菌克?。罕緦?shí)驗(yàn)室篩查、鑒定并保存[5]；

TakaraExTaq酶：5 U/μL，不含Mg2+，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；

dNTP Mixture：各2.5 mmol/L，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；

MgCl2：25 mmol/L，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；

PCR引物(表1)：10 μmol/L，生工生物工程(上海)股份有限公司；

腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(Brain heart infusion broth, BHI)、LB培養(yǎng)基和瓊脂粉：英國(guó) Oxoid公司；

GelStain凝膠電泳染料、2K DNA marker、瓊脂糖、6×DNA Loading Buffer、50×TAE電泳緩沖液、氨芐西林(Ampicillin，Amp)、雙蒸水(dd H2O)： 北京全式金生物技術(shù)有限公司；

四環(huán)素：美國(guó)藥典級(jí)，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

PCR儀：T100型，美國(guó)Bio-Rad公司；

電泳儀：Powerpac Universal型，美國(guó)Bio-Rad公司；

凝膠成像分析系統(tǒng)：GelDoc XR+Imager型，美國(guó)Bio-Rad公司；

電泳槽：DYCP-31E型，北京六一生物科技有限公司；

微量移液槍：Research Plus型，德國(guó)Eppendorf公司；

高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)：Centrifuge 5424 R型，德國(guó)Eppendorf公司；

超凈工作臺(tái)：SW-CJ-2FD型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

搖床：TQ2-312型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DHG-9203A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 四環(huán)素耐藥基因片段陽(yáng)性克隆DNA模板的制備

根據(jù)夏樂(lè)先等[21]和劉宗保[22]的方法修改后制備四環(huán)素耐藥基因tetA、tetD、tetG、tetS和tetX片段陽(yáng)性克隆的DNA模板。菌株用含100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基增殖8 h后，取2 mL菌液，12 000 r/min離心3 min，棄去上清液，無(wú)菌條件下加入2 mL生理鹽水，振蕩懸浮混合均勻，再用生理鹽水依次10倍梯度稀釋至10-1～10-8，依次取200 μL 稀釋菌液均勻涂布于固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，菌落計(jì)數(shù)并計(jì)算對(duì)應(yīng)稀釋液的活菌數(shù)，同時(shí)，依次取2 mL 稀釋菌液懸浮3 min，沸水浴 10 min后立即冰浴15 min，即得粗提DNA，-20 ℃保存，作為PCR反應(yīng)的模板。

表1 四環(huán)素耐藥基因引物

1.2.2 多重PCR預(yù)試驗(yàn)

(1) 單重PCR靈敏性試驗(yàn)：以5種四環(huán)素耐藥基因片段陽(yáng)性克隆的粗提DNA為模板，進(jìn)行單重PCR并用瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，結(jié)合稀釋菌液計(jì)數(shù)結(jié)果，初步確定5種耐藥基因的單重PCR靈敏性。

(2) 多重PCR預(yù)試驗(yàn)：根據(jù)單重PCR的靈敏性，對(duì)5種耐藥基因陽(yáng)性克隆稀釋菌液分別選擇合適的稀釋濃度下的粗提DNA模板，等比例混合后作為多重PCR的模板，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

(3) 反應(yīng)體系：混合DNA模板5 μL，Taq酶0.25 μL，每種基因的正向引物和反向引物各1.0 μL，dNTP 4 μL，MgCl24 μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液5 μL，最終用 dd H2O補(bǔ)齊至50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。以去離子水為模板作陰性對(duì)照。瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.3 多重PCR參數(shù)優(yōu)化

(1) 引物濃度的優(yōu)化：在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)各基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度，按照表2進(jìn)行引物濃度優(yōu)化試驗(yàn)。

(2)Taq酶濃度的優(yōu)化：在引物濃度優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上優(yōu)化Taq酶的濃度，在多重PCR反應(yīng)體系中分別添加0.25(1.25 U)，0.50 (2.50 U)，1.00 (5.00 U)，1.50 μL(7.50 U)Taq酶，考察Taq酶濃度對(duì)擴(kuò)增效果的影響。

(3) 退火溫度的優(yōu)化：依次選取53，55，57，58 ℃作為退火溫度，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)體系退火溫度的優(yōu)化試驗(yàn)。

表2 多重PCR體系引物濃度的優(yōu)化

1.2.4 多重PCR的靈敏度和特異性分析 在多重PCR參數(shù)優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對(duì)混合DNA模板進(jìn)行10倍梯度稀釋(10-1，10-2，10-3)，考察多重PCR方法的靈敏度。粗提耐藥基因tetA、tetD、tetE、tetG、tetL、tetM、tetO、tetR、tetS、tetT、tetX、sul1和sul2片段陽(yáng)性克隆菌株的DNA，以優(yōu)化的反應(yīng)條件和體系進(jìn)行PCR，檢測(cè)該多重 PCR方法的特異性。

1.2.5 禽源四環(huán)素耐藥菌的5種耐藥基因檢測(cè) 23株已鑒定四環(huán)素耐藥基因攜帶情況的禽源四環(huán)素耐藥菌(表3)在含有16 μg/mL四環(huán)素的BHI液體培養(yǎng)基活化后粗提DNA，分別用上述優(yōu)化后的多重PCR體系進(jìn)行耐藥基因的檢測(cè)，驗(yàn)證方法的實(shí)用性。

表3用于驗(yàn)證多重PCR方法實(shí)用性的23株禽源四環(huán)素菌

Table3 23 strains of poultry tetracycline resistant bacteria used for verify the utility of multi-PCR system

菌株序號(hào)攜帶四環(huán)素耐藥基因種屬革蘭氏染色特性1tetABrochothrix thermosphactaG+2tetAStenotrophomonas spG-3tetA、tetSlactic acid bacteriumG+4tetA、tetDSphingobacterium spG-5tetDMacrococcus caseolyticusG+6tetSCarnobacterium spG+7tetXAeromonas spG-8tetA、tetDKurthia spG+9tetA、tetDPseudomonas spG-10tetA、tetDAeromonas spG-11tetA、tetDBrochothrix thermosphactaG+12tetSMacrococcus caseolyticusG+13tetXStaphylococcus spG+14tetSAcinetobacter spG-15tetAPseudomonas spG-16tetSCarnobacterium spG+17tetS、tetXMyroides marinusG-18tetSMacrococcus caseolyticusG+19tetA、tetSCarnobacterium spG+20tetSCarnobacterium spG+21tetSCarnobacterium spG+22tetSCarnobacterium spG+23tetS、tetXSphingobacterium spG-

2 結(jié)果與分析

2.1 單重PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

用梯度稀釋菌液的粗提DNA作為模板，對(duì)5種耐藥基因進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增(圖1)。選擇比目的條帶可見的稀釋梯度高1～2個(gè)梯度的稀釋度，即tetA10-4、tetX10-4、tetG10-3、tetD10-4、tetS10-4，作為多重PCR中混合DNA的模板稀釋度。稀釋菌液的平板計(jì)數(shù)結(jié)果表明，tetA、tetX、tetG、tetD、tetS陽(yáng)性克隆菌株菌懸液原始濃度為5.1×108，7.6×108，4.3×107，4.5×108，9.2×108CFU/mL，再將各被選中的DNA模板稀釋5.1，7.6，4.3，4.5，9.2倍，制成104CFU/mL的菌液DNA粗提物，等比混合后獲得用于開發(fā)多重PCR方法的DNA模板。

在多重PCR體系中，隨著檢測(cè)基因位點(diǎn)的增多，即引物數(shù)量的增加，每條目的基因的擴(kuò)增效率會(huì)受到影響，某種特異性條帶優(yōu)先進(jìn)行PCR反應(yīng)，而部分條帶甚至無(wú)法獲得擴(kuò)增[23]。在本研究中也出現(xiàn)了類似的情況，當(dāng)多種DNA模板和引物混合反應(yīng)后，部分在單重PCR中能夠順利擴(kuò)增的條帶不再呈現(xiàn)目的條帶。采取階梯增加引物的策略，調(diào)整新加入的引物濃度直至獲得擴(kuò)增，使得PCR體系從一重增加至五重(圖2)。但用該體系和程序?qū)?shí)際細(xì)菌樣品進(jìn)行5種耐藥基因的篩查時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分基因無(wú)法擴(kuò)增，因此需要優(yōu)化多重PCR的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序。

圖1 不同稀釋度DNA粗提液的單重PCR擴(kuò)增結(jié)果

Figure 1 The amplification of five tet genes in single PCR with diluent templates

M. 2 K Maker 1. 四環(huán)素耐藥基因五重PCR擴(kuò)增條帶 -. 陰性對(duì)照

圖2 多重PCR預(yù)試驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果

Figure 2 Preliminary amplification of multiple PCR

2.2 多重PCR條件優(yōu)化

2.2.1 引物濃度 當(dāng)tetA、tetX、tetG、tetD和tetS的引物濃度分別為0.1，0.1，0.2，0.2，0.2 μmol/L(即5對(duì)引物的單條引物添加量分別為0.5，0.5，1.0，1.0，1.0 μL，濃度比為1∶1∶2∶2∶2，圖3，泳道3)時(shí)，5個(gè)目的基因的擴(kuò)增條帶亮度相近，均能得到比較好的擴(kuò)增且無(wú)非特異性條帶。

2.2.2Taq酶濃度 當(dāng)多重PCR體系中的Taq酶添加量為1 μL(即Taq酶的終濃度為0.1 U/μL)時(shí)，5條目的條帶最為清晰(圖4，泳道3)。

2.2.3 退火溫度 對(duì)多重PCR反應(yīng)的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)退火溫度高至58 ℃時(shí)(圖5)，部分條帶不再擴(kuò)增，因此選擇55 ℃作為多重PCR的退火溫度。

綜上，優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系為：混合DNA模板5 μL，Taq酶1 μL，tetA和tetX的正反向引物各0.5 μL，tetG、tetD和tetS的正反向引物各1.0 μL，dNTP 4 μL，MgCl24 μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液5 μL，最終用 dd H2O補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

M. 2 K Maker 1～5.tetA、tetX、tetG、tetD和tetS的引物濃度比分別為1∶1∶1∶1∶2，1∶1∶1∶2∶2，1∶1∶2∶2∶2，1∶2∶2∶2∶2，1∶2∶2∶2∶4 6～10. 1～5組的陰性對(duì)照

圖3 不同濃度的引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增

Figure 3 Amplification of multiple PCR using primers with different concentrations

M. 2 K Maker 1～4.Taq酶添加量分別為0.25，0.50，1.00，1.50 μL 5～8. 1～4組的陰性對(duì)照

圖4 多重PCR體系中添加不同體積Taq酶的擴(kuò)增結(jié)果

Figure 4 Amplification of multiple PCR usingTaqwith different concentrations

M. 2 K Maker 1～4. 退火溫度分別為53，55，57，58 ℃ 5～8. 1～4組的陰性對(duì)照

圖5 不同退火溫度對(duì)多重PCR擴(kuò)增的影響

Figure 5 Amplification of multiple PCR with different annealing Temperature

2.3 多重PCR的靈敏度和特異性

為了確定多重PCR體系的靈敏度，基于優(yōu)化的PCR擴(kuò)增條件和反應(yīng)程序，將含104CFU/g菌落的粗提DNA混合模板稀釋成10.00%，1.00%，0.10%分別進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明，當(dāng)混合DNA模板被稀釋到0.10%時(shí)，使用本方法已檢測(cè)不到tetS基因，而1.00%的稀釋模板仍能擴(kuò)增出所有5條目的條帶(圖6)。因此，本多重PCR反應(yīng)的靈敏度為102CFU/g。

以13種耐藥基因的陽(yáng)性克隆菌株的粗提DNA為模板，用優(yōu)化的多重PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，考察體系的特異性。結(jié)果表明，本方法僅可以檢測(cè)5種目的耐藥基因，對(duì)不含目的耐藥基因的樣品無(wú)法擴(kuò)增出條帶(圖7)。因此本多重PCR體系具有較好的特異性。

M. 2 K Maker 1～4. 模板稀釋梯度分別為10-3，10-2，10-1，1005～8. 1～4組的陰性對(duì)照

圖6 不同稀釋梯度的混合DNA模板的多重PCR擴(kuò)增結(jié)果

Figure 6 Amplification of multiple PCR using templates with different dilutions

1～16. 分別以tetA、tetA+tetD、tetA+tetG、tetS、tetX、sul1、sul2、tetE、tetM、tetT、tetO、tetR、tetA+tetX、tetA+tetS、tetA+sul1、tetA+tetX+tetS的陽(yáng)性克隆菌為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的樣品 M. 2 K Maker -. 陰性對(duì)照

圖7 特異性驗(yàn)證結(jié)果

Figure 7 Specificity of the multi-PCR system

2.4 禽源四環(huán)素耐藥菌的耐藥基因檢測(cè)

用建立的多重PCR體系和反應(yīng)程序檢測(cè)23株本實(shí)驗(yàn)室篩查獲得并鑒定保存的禽源四環(huán)素耐藥菌，檢測(cè)結(jié)果與普通單重PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致(表3，圖8)。23株禽源耐藥菌屬于11個(gè)種屬，包括肉桿菌(Carnobacteriumsp)、溶酪大球菌 (Macrococcuscaseolyticus)、鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriumsp)、氣單胞菌(Aeromonassp)、假單胞菌(Pseudomonassp)、熱死環(huán)絲菌(Brochothrixthermosphacta)、庫(kù)特氏菌(Kurthiasp)、寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonassp)、乳酸菌(lacticacidbacterium)、海洋類香味菌(Myroidesmarinus)、不動(dòng)桿菌(Acinetobactersp)，且既有革蘭氏陰性菌又有革蘭氏陽(yáng)性菌。因此，本研究建立的多重PCR體系能廣譜地應(yīng)用于禽源細(xì)菌的5種耐藥基因篩查檢測(cè)。

M. 2 K Maker 1～23. 實(shí)驗(yàn)室篩查獲得并鑒定的四環(huán)素耐藥菌菌株 -. 陰性對(duì)照

圖8 用多重PCR篩查23株四環(huán)素耐藥菌中5種四環(huán)素耐藥基因的存在情況

Figure 8 Screening of five tetracycline resistance genes by multi-PCR system in 23 poultry isolates of tetracycline resistant bacteria

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化四環(huán)素耐藥基因引物的濃度、TaqDNA聚合酶濃度和退火溫度等因素，建立了可以同時(shí)檢測(cè)5種四環(huán)素耐藥基因tetA、tetX、tetG、tetD和tetS的多重PCR方法，靈敏度為102CFU/mL，可用于雞源革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌中四環(huán)素耐藥基因的快速篩查。目前已發(fā)現(xiàn)40多種四環(huán)素耐藥基因[1]，且在雞肉產(chǎn)品[5]和飼養(yǎng)環(huán)境[24-25]中還存在除本研究所涉5種基因以外的其他多種四環(huán)素耐藥基因，因此，還需繼續(xù)開發(fā)其他禽源四環(huán)素耐藥基因的多重PCR檢測(cè)技術(shù)，以滿足細(xì)菌中四環(huán)素耐藥基因的大規(guī)模篩查研究的需求。