康 寧高媛惠高利珍
KANG Ning1,2 GAO Yuan-hui2 GAO Li-zhen1
(1. 太原理工大學,山西 太原 030024;2. 中華人民共和國太原海關,山西 太原 030024)
(1. Taiyuan University of Technology, Taiyuan, Shanxi 030024, China; 2. Taiyuan Customs District, Taiyuan, Shanxi 030024, China)
保健食品屬于食品的一個分支,能調節(jié)人體的機能,適用于特定人群使用,但不以治療疾病為目的[1-2]。隨著公眾健康保健意識的不斷增強,對保健食品的需求十分旺盛。為了使保健品達到宣傳的預期效果,不法企業(yè)選擇向保健品中添加具有治療效果的藥物[3-4],以此來賺取高額利潤。目前保健食品中呈現(xiàn)出的非法化學藥物添加,有以下現(xiàn)象:添加物的來源不明[5-8],非法添加藥物的劑量隨意[9],非法添加藥物的兼容性不明確[10];而且非法添加現(xiàn)象較為嚴重。如果消費者長期服用這些含有違禁化學物質的保健食品,會直接影響身體健康,極大地損害了消費者的身心健康和經(jīng)濟利益。
近年來,對于降壓類、降糖類及減肥類等保健品中非法添加物的研究進展較多[11-13],國內(nèi)外文獻對安神類保健品非法添加的研究也有報道[14-16]。目前中國食藥總局發(fā)布了保健食品中非法添加物目錄,其中青藤堿、羅通定、扎來普隆、文拉法辛、褪黑素5種在名單內(nèi),都屬于國家嚴格監(jiān)管的一類藥品,如果使用不當或濫用將造成嚴重不良后果,如出現(xiàn)困倦、乏力、頭暈,嚴重時還可能導致昏迷[17]。然而,目前對青藤堿、羅通定、扎來普隆、文拉法辛、褪黑素等5種安神類藥物作為保健品的非法添加物的檢測方法尚未見到,僅有對藥物本身檢測方法的研究[18-22]。
液相色譜—串聯(lián)飛行時間質譜法(LC-Q-TOF-MS)是近幾年發(fā)展起來的一種高端串聯(lián)質譜技術,在藥物分析、食品分析、環(huán)境分析等眾多領域得到廣泛的應用[23-24],高分辨質譜儀較低分辨質譜儀分析速度快、靈敏度高、分辨率高、選擇性強,特別是對于復雜樣品的分析與鑒定有不可替代的作用。目前對上述5種安神類藥物的研究均采用的是普通液相色譜串聯(lián)質譜儀,尚未見高分辨質譜儀應用于保健品中非法添加檢測方法的研究[25-27]。
本研究擬采用LC-Q-TOF-MS檢測安神類保健食品中的非法添加物,并探索試驗條件及優(yōu)化檢測參數(shù)設定,以期建立出一種快速、高效、靈敏的安神類保健食品中非法添加物(青藤堿、羅通定、扎來普隆、文拉法辛、褪黑素)的檢測方法,為中國保健食品中違法添加安神類藥物提供檢測依據(jù)。
改善睡眠類的保健食品:膠囊A (0.35 g/粒)、口服液B(15 mL/支)、膠囊C(0.5 g/粒)、膠囊D(0.5 g/粒)、茶劑E(4 g/袋)、膠囊F(0.35 g/粒),研碎,盡量使樣品均勻,正規(guī)藥店購買;
乙腈、甲醇:色譜純,美國Fisher 公司;
乙酸銨:分析純,天津市化學試劑廠;
試驗用水均為去離子水;
試驗所需的標準品及其相關信息如表1所示。
表1 5種化合物標準品及其相關信息
液相色譜儀:Agilent Technologies 1290型,美國安捷倫科技有限公司;
飛行時間質譜儀:Agilent Technologies 6540型,美國安捷倫科技有限公司;
電子分析天平:XS204型,瑞士Mettler公司;
渦旋混合器:945617型,美國TALBOYS公司;
超聲波:KQ-500DB型,昆山舒美超聲儀器有限公司。
1.3.1 定性分析中色譜條件的優(yōu)化
(1) 1 000 mg/L非法添加物單標準儲備溶液:分別稱取按質量折算為100%的標準品(純度≥ 99.2%)10.00 mg于10 mL的容量瓶中,青藤堿、文拉法辛、扎來普隆用甲醇溶解并稀釋至刻度,羅通定用三氯甲烷溶解并稀釋至刻度,褪黑素用70%甲醇溶解并稀釋至刻度,將配置好的各個單標準溶液于-18 ℃下保存。
(2) 1 000 mg/L標準溶液:移取各標準儲備溶液,用甲醇溶液配置,再用甲醇稀釋成10,100,500,800,1 000 μg/L的混合標準系列濃度溶液。選擇 Agilent C18色譜柱(1.9 μm,2.1 mm×50 mm);將提前配制的 5 種非法添加物(青藤堿、羅通定、扎來普隆、文拉法辛、褪黑素)的混標溶液進樣,流量0.3 mL/min;進樣量10 μL;柱溫30 ℃;按表 2 進行梯度洗脫;流動相 A 為甲醇,流動相 B 分別設定為水、0.1%(體積分數(shù))甲酸溶液、含 20 mmol/L乙酸銨的0.1%(體積分數(shù))甲酸溶液外,其他條件同1.3.1(1),進行3次試驗,選擇 5 種化合物響應值最高的為試驗所選B路流動相。
表2 梯度洗脫程序
1.3.2 定性分析中質譜條件的優(yōu)化 離子源為電噴霧離子化器(ESI);檢測方式為正離子;離子源噴射電壓5.5 kV,毛細管電壓135 kV;脫溶劑氣溫度500 ℃,脫溶劑氣流量800 L/h。掃描方式為一級、二級全掃描,全掃描數(shù)據(jù)采集可以得到化合物的一級母離子精確質量數(shù),以及二級定性離子對的精確質量數(shù)。
1.3.3 定量分析方法
(1) 檢出限和定量限:取1 mg/L的5種非法添加物的混合標準溶液貯備液,用甲醇稀釋成一定質量濃度的溶液后測定各化合物的信噪比,依據(jù)檢出限為3倍信噪比(S/N=3),定量限為10倍信噪比(S/N=10),計算出該方法的檢出限和定量限。
(2) 線性關系考察:取安神類非法添加物混合標準溶液,用甲醇稀釋配制成濃度梯度溶液為10,100,500,800,1 000 μg/L,濃度由低至高依次進行LC-Q-TOF/MS分析。以峰面積(Y)為縱坐標,濃度(X)為橫坐標,繪制標準曲線。
(3) 回收率和精確度:取空白的陰性樣品1.0 g于3支50 mL離心管中,并在每支試管中分別加入適量的羅通定、青藤堿、文拉法辛、褪黑素、扎來普隆,用甲醇稀釋至10 mL,配制成含有這5種非法添加物濃度為10.0,50.0,100.0 μg/L 3個加標溶液,超聲20 min,靜置10 min后,取其上清液過0.22 μm 微孔濾膜,然后進入該儀器進行分析,平行測定6次。根據(jù)外標法計算這5種非法添加物的回收率,并計算該方法的精確度。
1.3.4 樣品含量的測定
(1) 樣品預處理:對于膠囊劑,取10粒膠囊,取出內(nèi)容物,將膠囊殼剪碎,與內(nèi)容物混勻并研磨;對于茶劑,取少量進行研磨;對于口服制劑,量取1次口服劑量。
(2) 樣品提?。簻蚀_稱取1.00 g(精確至 0.01 g)試樣至50 mL離心管中,加入10.00 mL甲醇溶液超聲提取20 min,靜止10 min后,取上層清液,用0.22 μm微孔濾膜過濾,備用。
(3) 根據(jù)試驗所建立的方法,對待測樣品中的 5 種非法添加物進行定性定量分析。
2.1.1 流動相的優(yōu)化 由于電噴霧質譜的電離是在溶液狀態(tài)電離,因此流動相的組成和添加劑除了影響分析物的保留時間和峰形外,還會影響分析物的離子化效率,從而影響到目標化合物的檢測靈敏度。本試驗分別采用甲醇和水,甲醇和 0.1%甲酸,甲醇和含20 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸溶液作為流動相,考察不同流動相組成對分析物峰形及離子化效率的影響,5 種化合物在不同流動相的條件下所對應的響應值見表 3。如圖 1 所示,圖1(c)中青藤堿的峰形最好、響應值最高,因此青藤堿的流動相選甲醇和含20 mmol 乙酸銨的0.1%甲酸溶液。而羅通定、文拉法辛、扎來普隆在3種不同流動相下的色譜圖分析結果同青藤堿類似,因此,羅通定、青藤堿、文拉法辛、扎來普隆的流動相都選用甲醇和含20 mmol/L 乙酸銨的0.1%甲酸溶液。
由圖2可知,褪黑素在后2個圖中峰形不夠好,但仍然是在圖2(c)中響應值最高,因此褪黑素的流動相依然選擇甲醇和含20 mmol/L 乙酸銨的0.1%甲酸溶液。
圖1 青藤堿在3種流動相條件下的色譜圖
圖2 褪黑素在3種流動相條件下的色譜圖
由3可知,0.1%甲酸溶液和含20 mmol/L乙酸銨的0.1% 甲酸溶液作為流動相B 時,5 種非法添加物的響應值遠遠高于以水為流動相B的;而含20 mmol/L 乙酸銨的0.1% 甲酸溶液又比0.1% 甲酸溶液的響應值較好。因此對5種非法添加物的流動相都選用甲醇和含20 mmol/L乙酸銨的0.1%的甲酸溶液。
2.1.2 碰撞能量的優(yōu)化 碰撞能量對一級母離子打碎成為二級質譜離子起著至關重要的作用,通過改變碰撞能量的大小,使得母離子以不同的動能與碰撞池中的碰撞氣相撞,動能轉化為內(nèi)能,轉化的越多,越有利于母離子打碎。對每一種化合物來說,其母離子只能打碎成一些特定的二級質譜離子,在這些碎片離子中,找出該化合物的2個響應值最高的二級碎片離子,作為該化合物的特征離子對,即該化合物的定性離子對。
表3 5種非法添加物在3種流動相B下對應的響應值
在離子源為電噴霧離子化器(ESI);檢測方式為正離子;離子源噴射電壓 5.5 kV,毛細管電壓 135 kV;脫溶劑氣溫度500 ℃,脫溶劑氣流量800 L/h。錐孔電壓135 kV和碰撞能量(10~35 eV)進行了優(yōu)化。經(jīng)過一級、二級全掃描模式,全掃描數(shù)據(jù)采集可以得到化合物的一級母離子精確質量數(shù),以及二級定性離子對的精確質量數(shù)。通過對試驗過程中的碰撞能量進行梯度設定,檢測目標化合物的定性離子對響應值最高時碰撞能量,例如青藤堿在不同的碰撞能量梯度下的二級質譜圖見圖 3。
圖3 青藤堿在碰撞能量梯度下的二級質譜圖
從圖3可以看出,隨著碰撞能量的增加,青藤堿中的一部分二級碎片離子的響應值越來越高,逐漸從該化合物的全部二級碎片離子中突顯出來。181.064 6和207.044 3 2個二級碎片離子的響應值較高。因此,對于青藤堿,宜以181.064 6和207.044 3 作為該化合物的定性離子對。由圖 3還發(fā)現(xiàn),對于 181.064 6在碰撞能量為 30 eV 的條件下,響應值最高,對于207.044 3在碰撞能量為35 eV時,響應值最高。
同理根據(jù) 5 種非法添加物的二級質譜圖,對5種非法添加物的定性離子對及最優(yōu)碰撞能量進行了統(tǒng)計,見表4。
由表 4 可以看出,5 種非法添加物的一、二級質譜離子的質量數(shù)都精確到了小數(shù)點后4位,具有超高精確度和準確度,且 5 種非法添加物的保留時間為 2.0~3.2 min,分析速度快。
2.1.3 建立5種非法添加物檢測的方法參數(shù) 通過所確立最佳的試驗條件設置的各試驗參數(shù),建立了安神類保健品5 種非法添加物的數(shù)據(jù)庫。優(yōu)化后的方法參數(shù)如表 5 所示。
2.2.1 檢出限和定量限測定 取混合標準溶液貯備液,用甲醇稀釋成一定質量濃度的溶液后測定各化合物的信噪比,依據(jù)檢出限為3倍信噪比(S/N=3),定量限為10倍信噪比(S/N=3),結果如表6所示。
由表6可以看出,5 種非法添加物的檢出限≤0.9 μg/L,定量限都≤3 μg/L,說明所建立的試驗方法靈敏度高、準確度強。
表4 質譜條件的優(yōu)化結果
表5 方法參數(shù)一覽表
表6 5種化合物的檢出限和定量限
2.2.2 線性關系考察 分別精密取各標準儲備液適量,用甲醇稀釋成10,100,500,800,1 000 μg/L的混合標準系列濃度溶液,用液相色譜—串聯(lián)飛行時間質譜的試驗方法進行測定。以化合物一級精密質量數(shù)的峰面積(Y)對相應質量濃度(X)建立標準曲線(圖4),線性關系如表7所示。
由圖4和表7可知,5種化合物在10~1 000 μg /L時線性關系良好,相關系數(shù)>0.99。進一步的證明本試驗所建立的方法精密度高、靈敏度強。
2.2.3 回收率與精密度 分別取空白的陰性樣品1.0 g于50 mL離心管中,并在每支試管中分別加入適量的羅通定、青藤堿、文拉法辛、褪黑素、扎來普隆,用甲醇稀釋至10 mL,以配制成含有這 5種非法添加物的10.0,50.0,100.0 μg/L 3個濃度的加標溶液,每個濃度需添加6次,超聲20 min,靜置10 min后,取其上清液過0.22 μm微孔濾膜,然后進行分析。根據(jù)外標法計算這5種非法添加物的回收率,并計算該方法的精確度,如表8所示。
圖4 5 種化合物的標準曲線
化合物線性回歸方程R2青藤堿 y=33.594x-24.5610.998 7羅通定 y=28.334x+27.2140.997 3文拉法辛y=1.583 7x+52.2350.995 9褪黑素 y=13.583x-299.870.994 7扎來普隆y=7.943 6x-473.190.990 2
表8 5種化合物的回收率與精密度
由表8可以看出,空白樣品中的平均回收率為92.8%~110.1%,精密度為0.9%~1.8%。更加進一步地證明本試驗所建立的方法靈敏度高、選擇性強。
采用本研究的方法對市售的6種安神類保健品進行檢測,只有膠囊D檢出了青藤堿,經(jīng)定量分析測得青藤堿含量為1.656 mg/kg,其他5種樣品均未檢出5種藥物。
對膠囊D的一級質譜圖進行分析,可以提取出質荷比(m/z)為330.168 8 的化合物,且該化合物的保留時間為 2.176 min(圖5),與青藤堿標準溶液的一級質譜圖吻合,可以基本確定膠囊D中添加了青藤堿。
圖5 膠囊D的青藤堿質譜圖
為了進一步確證該樣品中含有非法添加物青藤堿,對樣品的二級質譜圖進行分析見圖6。由圖6可知,響應強度較高的2個碎片離子分別為 181.069 7和207.044 3,與青藤堿的定性離子對181.064 5和207.043 8 吻合,且質荷比在偏差范圍內(nèi),因此,可以確定膠囊D中330.168 8 的色譜峰為青藤堿。
圖6 膠囊D的二級質譜圖
本試驗建立了一種同時檢測安神類保健食品中青藤堿、羅通定、扎來普隆、文拉法辛、褪黑素5種非法添加物的方法。該法分析速度快、靈敏度高、選擇性強、精密度高,定性和定量一次完成,回收率和精密度均能滿足國家標準的要求,可用于保健品中安神類非法添加物的檢測。但本試驗僅研究了5種化合物,后續(xù)宜擴大這類非法添加物的種類,使中國保健品食品檢測技術更加成熟,適用性更廣。