沈浙南　沈秋平　彭求

摘要：棉花（Gossypium spp.）是重要的纖維作物，棉花微管蛋白基因在棉纖維發(fā)育過(guò)程中特異優(yōu)勢(shì)表達(dá)，影響棉纖維品質(zhì)。微管蛋白基因Ghtub12為Tubulin基因家族中的一員，在棉纖維發(fā)育中機(jī)理尚不明確。以陸地棉（Gossypium hirsutum Linn.）R15下胚軸為受體，以0.5 mg/L Basta為篩選標(biāo)記，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Ghtub12遺傳轉(zhuǎn)化棉花。100個(gè)胚軸段經(jīng)過(guò)抗性愈傷組織誘導(dǎo)，得到143塊愈傷組織，出愈率為71.50%；再經(jīng)過(guò)3次抗性篩選獲得126塊愈傷組織，對(duì)愈傷組織進(jìn)行PCR檢測(cè)，102塊檢測(cè)出bar基因，即抗性愈傷組織轉(zhuǎn)化率為81.00%；其中有45塊愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織，分化率為44.12%。胚性愈傷組織進(jìn)行成苗培養(yǎng)得60株苗，對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)，56株擴(kuò)增出條帶，陽(yáng)性率為93.3%。獲得了轉(zhuǎn)微管蛋白基因Ghtub12棉花，為進(jìn)一步研究Ghtub12基因在棉花中的可能機(jī)理和作用提供了試驗(yàn)材料。

關(guān)鍵詞：陸地棉（Gossypium hirsutum Linn.）R15；陸地棉微管蛋白基因Ghtub12；農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；下胚軸

中圖分類號(hào)：S562 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）18-0106-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.18.027 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on Micro-tubulin Gene Ghtub12 to Cotton in Gossypium hirsutum

SHEN Zhe-nan，SHEN Qiu-ping，PENG Qiu，LYU Zun-fu，LI Fei-fei

（College of Agriculture，Zhejiang A&F; University，Hangzhou 311300，Zhejiang，China）

Abstract： Cotton is the world's important fiber crop， cotton tubulin gene in cotton fiber development process specific advantages of expression， affecting cotton fiber quality. Tubulin gene Ghtub12 as a member of the tubulin gene family， the mechanism of cotton fiber development is not clear. In this experiment， R15 hypocotyls were used as acceptor， and 0.5 mg/L Basta was used as a screening marker. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation method was used to study the genetic transformation. 100 calli were induced by resistance callus， and 143 callus were obtained after 1 month. The recovery rate was 71.50%. After 3 times， the callus was obtained and the callus was obtained. The transformation rate was 81.00%. Among them， 45 callus induced embryogenic callus， the differentiation rate was 44.12%. Embryogenic calli were divided into 60 seedlings. The positive rate was 93.3%. The transgenic tubulin gene Ghtub12 was obtained， which provided experimental material for further study on the possible mechanism and effect of Ghtub12 gene in cotton.

Key words： Gossypium hirsutum Linn. R15； Gossypium tubulin gene Ghtub12； agrobacterium-mediated method； hypocotyls

棉花（Gossypium spp.）是重要經(jīng)濟(jì)作物，常以雜交育種來(lái)提高棉花產(chǎn)量和增進(jìn)棉花品質(zhì)[1]。但研究發(fā)現(xiàn)棉花產(chǎn)量和品質(zhì)在遺傳上存在一定負(fù)相關(guān)，通過(guò)常規(guī)育種很難短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)同步提升[2]。隨著植物生物技術(shù)的發(fā)展，人們通過(guò)外源基因?qū)朊藁ɑ蚪M，能有效提高棉花產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)打破物種間生殖隔離，有目的地將優(yōu)良基因?qū)朊藁╗4]?，F(xiàn)常將轉(zhuǎn)基因育種和常規(guī)育種結(jié)合，在短期內(nèi)可有效提高棉花產(chǎn)量[5]。目前，國(guó)內(nèi)外已培育出抗除草劑（轉(zhuǎn)bar基因等）[5]、抗蟲（轉(zhuǎn)bt基因等）[6，7]、抗?。ㄞD(zhuǎn)ptsI基因、hpaXm基因等）[8-10]、抗逆境（轉(zhuǎn)GhGR基因等）[8]和優(yōu)良品質(zhì)改良（轉(zhuǎn)14-3-3L基因等）[11，12]等轉(zhuǎn)基因棉花?？瓜x棉已在國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)廣泛推廣并種植[13]。

目前，棉花轉(zhuǎn)基因常用方法是以棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生為再生方式的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法受棉花基因型限制，僅在部分陸地棉上成功，如珂210、珂312、中棉所系列[14，15]。2007年吳慎杰等[16]將基因Gus導(dǎo)入泗棉3號(hào)下胚軸，愈傷組織誘導(dǎo)率73.7%，分化率3.6%。2013年歐婷[17]用農(nóng)桿菌將基因EPSPs-G6導(dǎo)入中棉所49莖段，轉(zhuǎn)化率4.6%；2014年肖向文等[18]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Agip1基因?qū)胄玛懺?3號(hào)棉花下胚軸，在Basta濃度為2.5 mg/L的條件下出愈率21.9%，抗性愈傷率19.1%。2016年蔡云巧[19]用農(nóng)桿菌LBA4404將基因ATSUS3導(dǎo)入CRR14棉花下胚軸，出愈率92.5%，分化率21%。2016年肖松華等[20]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Gafp基因?qū)腙懙孛尢K研060下胚軸，出愈率71.4%，分化率4.1%。

棉花是重要纖維作物，纖維品質(zhì)對(duì)棉花經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有重大影響。棉纖維發(fā)育過(guò)程可劃分為4個(gè)階段，即纖維起始、初生壁形成、次生壁形成、纖維脫水成熟[21]。在棉纖維初生壁和次生壁形成期，主要進(jìn)行細(xì)胞伸長(zhǎng)與生長(zhǎng)，該過(guò)程對(duì)棉花纖維品質(zhì)產(chǎn)生重要影響，初生壁階段直接影響棉花纖維長(zhǎng)度，次生壁階段直接影響纖維強(qiáng)度[22]。Tubulin基因家族與纖維伸長(zhǎng)具有相關(guān)性，即在棉纖維伸長(zhǎng)期與微管蛋白有著密切的關(guān)系。Chandler等[23]于1978年前提出“multi-tubulin”假說(shuō)，認(rèn)為不同微管蛋白異型體組成了細(xì)胞內(nèi)不同微管結(jié)構(gòu)。由α微管蛋白和β微管蛋白二聚體組成微管蛋白的基本單位。2002年李園莉等[24]用EST方法得到一個(gè)微管蛋白基因Ghtub1，并用Noether雜交技術(shù)，對(duì)Ghtub1基因在不同器官和發(fā)育時(shí)期進(jìn)行跟蹤觀察。研究發(fā)現(xiàn)Ghtub1基因僅在纖維形成過(guò)程中進(jìn)行表達(dá)，即Ghtub1基因?qū)w維發(fā)育特異性發(fā)揮作用。2016年曾志峰[25]利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將Ghtub7基因轉(zhuǎn)入翼棉14中，發(fā)現(xiàn)Ghtub7在纖維次生壁形成過(guò)程中高效表達(dá)，對(duì)棉纖維強(qiáng)度與長(zhǎng)度有重要影響。當(dāng)Ghtub7在這一過(guò)程中過(guò)度表達(dá)時(shí)纖維長(zhǎng)度減少8.73%～12.20%，當(dāng)人為去抑制Ghtub7表達(dá)時(shí)纖維長(zhǎng)度會(huì)增加13.2%～15.2%。目前為止，已知的Tubulin基因家族在主要種植陸地棉中有38個(gè)成員，但在棉纖維發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控機(jī)理還未明確報(bào)道過(guò)。

Ghtub12基因在棉纖維初生壁形成期進(jìn)行優(yōu)勢(shì)表達(dá)，對(duì)棉花纖維品質(zhì)具有重要影響。本研究選取陸地棉R15為材料，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將微管相關(guān)基因Ghtub12轉(zhuǎn)化棉花R15下胚軸，經(jīng)抗性愈傷組織誘導(dǎo)和增殖、胚性愈傷組織誘導(dǎo)、胚狀體分化、成苗及PCR檢測(cè)等過(guò)程，獲得轉(zhuǎn)基因植株，為進(jìn)一步研究Ghtub12基因在纖維形成階段的作用機(jī)理和提高纖維品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

陸地棉R15種子，含Ghtub12基因農(nóng)桿菌LBA4404菌液。

1.2 方法

1.2.1 無(wú)菌苗培養(yǎng)及受體制備 取陸地棉R15種子用75%乙醇消毒30 s，30%H2O2浸泡3～4 h，在超凈臺(tái)上用無(wú)菌水洗滌3～5次，用無(wú)菌水浸泡過(guò)夜至種子露白。用無(wú)菌水洗滌露白種子2～3次，將處理好的種子按每瓶6顆接種C1培養(yǎng)基（1/2MS+8.5 g/L瓊脂）上，在28 ℃下暗培養(yǎng)使其萌發(fā)，待莖有明顯伸長(zhǎng)時(shí)，進(jìn)行光照處理。7～9 d后，取無(wú)菌苗下胚軸在超凈臺(tái)上切取剪0.5～1.0 cm作受體備用。

1.2.2 棉花遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程 含Ghtub12基因的農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)至OD600 nm為1.0左右，用液體培養(yǎng)基C2（MS+0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT）將菌液稀釋至OD600 nm為0.6～0.8。侵染R15的胚軸段8～10 min，用無(wú)菌濾紙吸干表面菌液，轉(zhuǎn)接至鋪濾紙的共培養(yǎng)C3培養(yǎng)基（MS+0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT+8.5 g/L瓊脂+30 g/L葡萄糖+50 mg/L AS）中，25 ℃，暗培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)后的下胚軸用含500 mg/L頭孢霉素?zé)o菌水洗滌1次，用無(wú)菌濾紙吸去水，然后按每瓶5段將其轉(zhuǎn)移到選擇C4培養(yǎng)基（MS+0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT+2.5 g/L Gelrite+30 g/L葡萄糖+0.75 g/L MgCl2+300 mg/L特美汀+0.5 mg/L Basta）上，25～30 d繼代一次，待抗性愈傷組織長(zhǎng)到直徑為3～5 mm時(shí)，將其從胚軸段切下來(lái)，按照每瓶5～6個(gè)愈傷組織來(lái)接種C4培養(yǎng)基，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。待愈傷組織增殖至直徑為7～8 mm時(shí)，轉(zhuǎn)接在胚性愈傷組織誘導(dǎo)C5培養(yǎng)基（MS+2.5 g/L Gelrite+30 g/L葡萄糖+0.75 g/L MgCl2+1.9 g/L KNO3）上，每25 d繼代一次。直至出現(xiàn)黃綠色或乳白色呈球形顆粒的胚性愈傷組織，及時(shí)將胚性愈傷組織單獨(dú)挑取繼代在C5培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖。將胚性愈傷組織散鋪在鋪濾紙的分化C6培養(yǎng)基（MS-NH4NO3+3.0 g/L Gelrite+30 g/L葡萄糖+0.75 g/L MgCl2+0.5 g/L天冬酰胺+1.0 g/L谷氨酰胺）上，每15 d繼代1次，約1～2個(gè)月可誘導(dǎo)胚狀體形成。胚狀體進(jìn)一步萌發(fā)成苗，將小苗單獨(dú)挑取出來(lái)繼代在C5培養(yǎng)基上，待長(zhǎng)出3～5片真葉時(shí)，溫室嫁接成活。

1.2.3 愈傷組織以及轉(zhuǎn)基因小苗的PCR檢測(cè) 用CTAB法提取愈傷組織和轉(zhuǎn)基因小苗葉片的DNA，用bar基因的引物（F：ACCATCGTCAACCACTACA TCG；R：GCTGCCAGAAACCCACGTCAT）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為420 bp。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化及分化

選取100個(gè)胚軸段作為轉(zhuǎn)化受體，60 d后，出現(xiàn)143塊愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率為71.5%。用Basta作為篩選標(biāo)記，經(jīng)3次篩選，獲得了126塊愈傷組織。每塊取部分愈傷組織進(jìn)行DNA提取，其余繼續(xù)增殖培養(yǎng)。用bar基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共有102塊愈傷組織擴(kuò)增出目的條帶，檢測(cè)轉(zhuǎn)化率為81.0%（圖1）。圖1是部分愈傷組織PCR檢測(cè)結(jié)果，除了泳道6和8外，均擴(kuò)增出目的條帶。

將102塊抗性愈傷組織進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)3～5次繼代，有45塊愈傷組織在培養(yǎng)基的接觸面出現(xiàn)胚性愈傷組織，分化率為44.12%（圖2）。

2.2 抗Basta轉(zhuǎn)化棉花和植株再生過(guò)程

R15種子經(jīng)過(guò)5～7 d培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗（圖3A）；5～7 cm的胚軸段和農(nóng)桿菌菌液侵染后，進(jìn)行共培養(yǎng)，將培養(yǎng)2 d后表現(xiàn)綠色，無(wú)褐化下胚軸（圖3B）轉(zhuǎn)入C4抗性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)2～3月培養(yǎng)，胚軸段顏色變深，兩端長(zhǎng)出抗性愈傷組織（圖3C）；出愈率為71.50%。待愈傷組織長(zhǎng)大直徑為3～5 cm，切下來(lái)單獨(dú)繼代在C4培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，待長(zhǎng)大7～8 cm（圖3D）時(shí)，轉(zhuǎn)入C5胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在愈傷組織和培養(yǎng)基接觸面出現(xiàn)淡黃色，小顆粒狀胚性愈傷組織（圖3E）；及時(shí)挑取，進(jìn)行增殖培養(yǎng)得到大量黃色胚性愈傷組織（圖3F）；轉(zhuǎn)入鋪有一層濾紙的C6培養(yǎng)基，部分胚性愈傷組織形成胚狀體（圖3G）。胚狀體單獨(dú)挑取進(jìn)一步發(fā)育成小苗（圖3H），共獲得了60顆轉(zhuǎn)基因棉花小苗。

2.3 轉(zhuǎn)基因小苗的PCR檢測(cè)

將獲得的60株小苗進(jìn)行bar基因PCR檢測(cè)。其中56株擴(kuò)增出目的條帶，陽(yáng)性率高達(dá)93.3%。說(shuō)明經(jīng)本試驗(yàn)選取0.5 mg/L Basta濃度是可行的。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Ghtub12基因?qū)腙懙孛轗15下胚軸，轉(zhuǎn)化后在抗性篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個(gè)月，從100段下胚軸中誘導(dǎo)出愈傷組織143塊，出愈率71.50%。用抗除草劑基因bar為標(biāo)記基因，0.5 mg/L Basta除草劑為篩選劑，經(jīng)過(guò)3個(gè)月篩選后，得126塊愈傷組織，對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)，102塊呈現(xiàn)目的條帶，轉(zhuǎn)化率81.00%。將102塊獲得的抗性愈傷組織進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)3～5個(gè)月后，得到胚性愈傷組織45塊，分化率44.12%。將胚性愈傷組織進(jìn)行分化成苗培養(yǎng)，得成活苗60株，有56株呈現(xiàn)陽(yáng)性，陽(yáng)性率93.3%。

目前，越來(lái)越多轉(zhuǎn)化方法被應(yīng)用于棉花轉(zhuǎn)基因過(guò)程中，如利用高速粒子沖擊的基因槍轉(zhuǎn)化法[26]，利用棉花自身生殖細(xì)胞分裂分化的花粉管通道法[27]等。本試驗(yàn)利用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化后代遺傳穩(wěn)定性好、試驗(yàn)技術(shù)成熟等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于棉花轉(zhuǎn)基因[28]。但農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法也存在幾個(gè)缺點(diǎn)，不僅對(duì)棉花受體自身基因型要求高（該方法普遍應(yīng)用于再生能力強(qiáng)的基因型），通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生建立組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體系相比其他方法更耗時(shí)耗力[29]。特別在組織培養(yǎng)體系中出愈率、轉(zhuǎn)化率、分化率、轉(zhuǎn)基因小苗陽(yáng)性率將直接影響這一轉(zhuǎn)化體系是否成功[29]。自棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)形成以來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系中影響棉花轉(zhuǎn)化效率因素有很多[30]。其中農(nóng)桿菌侵染液濃度、選用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比[31]、褐化程度對(duì)出愈率影響較大。選用的篩選劑及篩選劑濃度、篩選次數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化率有較大影響[32]。棉花品種[33]及受體選用部位[34]是影響棉花分化率主要因素[35]。本試驗(yàn)中用OD600 nm為0.8的農(nóng)桿菌菌液去侵染陸地棉R15下胚軸， KT：2，4-D配比為1，濃度為0.1 mg/L，在28 ℃下共培養(yǎng)，用0.5 mg/L Basta篩選3次后，出愈率達(dá)71.50%，轉(zhuǎn)化率達(dá)81.10%，分化率達(dá)44.12%。在篩選劑選擇方面，嘗試用在棉花下胚軸轉(zhuǎn)化體系中使用并非很廣泛的除草劑Basta，在經(jīng)過(guò)0.5 mg/L Basta篩選3次后，轉(zhuǎn)基因小苗陽(yáng)性率達(dá)93.3%。本試驗(yàn)中至少獲得了56株陽(yáng)性植株，說(shuō)明Basta篩選成功率較高，能有效地將轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織篩選出來(lái)。從轉(zhuǎn)化效率看，本轉(zhuǎn)化體系基本達(dá)到預(yù)期效果，為進(jìn)一步研究Ghtub12基因作用打下基礎(chǔ)。

Ghtub12基因作為一個(gè)微管蛋白基因，可能參與棉花纖維發(fā)育形成過(guò)程。結(jié)構(gòu)蛋白是棉纖維形成過(guò)程中的重要蛋白，在纖維細(xì)胞形成期對(duì)纖維細(xì)胞橫向與縱向排列有決定作用，進(jìn)而影響棉纖維長(zhǎng)度與厚度[36]。Ghtub12基因可能直接編碼成纖維形成過(guò)程中的結(jié)構(gòu)蛋白，通過(guò)結(jié)構(gòu)蛋白影響纖維排列方向，從而影響纖維結(jié)構(gòu)組成，進(jìn)一步影響纖維長(zhǎng)度與強(qiáng)度。棉纖維形成過(guò)程中受到各種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的調(diào)節(jié)，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在棉纖維成型過(guò)程表達(dá)時(shí)間與表達(dá)量，會(huì)直接影響纖維形成4個(gè)階段時(shí)間長(zhǎng)短，從而影響棉花品質(zhì)[37]。Ghtub12基因編碼成影響纖維形成相關(guān)激素蛋白，通過(guò)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的調(diào)節(jié)，影響纖維形成不同階段時(shí)間長(zhǎng)短，進(jìn)而影響纖維品質(zhì)。

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