渠文思，石家祺，石亞偉

（1.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西太原030006；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

鵝膏菌在真菌界屬于擔(dān)子菌門擔(dān)子菌綱傘菌目鵝膏菌科鵝膏菌屬[1]。鵝膏菌屬是世界性的大屬，目前，全世界該屬有1 000個名稱[2]，但被接受的約600種[3]，其中，我國已經(jīng)報道的有 110多種[4]，既有可食用的鵝膏菌，如橙蓋鵝膏菌（Amanita caesarea）、卵蓋鵝膏菌（Amanita ovoidea）、紅黃鵝膏菌（A－manita hemibapha）等，也有含毒的鵝膏菌，如黃綠毒鵝膏菌（Amanita phalloides）、暗花紋毒鵝膏菌（A－manita fuliginea）、鱗柄白鵝膏菌（Amanita virosa）等[5-6]，其中，紅黃鵝膏菌不僅營養(yǎng)美味，其含有的多糖還具有抗腫瘤和增強免疫的作用[7]；鱗柄白鵝膏菌在歐洲、北美被稱為“DestroyingAngel”（毀滅天使），其毒性極強，食用一小株就可能致人死亡。而且，大多數(shù)鵝膏菌屬與維管植物形成專性外生菌根關(guān)系，是樹木生長發(fā)育不可或缺的重要因子，在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。

傳統(tǒng)的真菌鑒定和分類主要依據(jù)形態(tài)特征，包括子實體菌蓋、菌柄、菌托和菌幕的不同形態(tài)特征以及孢子類型和孢子有性態(tài)[8]。但是通過形態(tài)觀察極易混淆，再加上人為觀察主觀因素的影響，不能充分地反映出物種的進化關(guān)系。我國幅員遼闊、氣候多變，地形多種多樣，土壤也有多種類型，因此形成大量豐富的植被和森林，眾多的鵝膏菌與不同植被共生，在長期協(xié)同進化過程中，形成了東亞所特有的鵝膏菌。我國部分鵝膏菌雖然與歐美的相似種外貌相似，但是內(nèi)部結(jié)構(gòu)和分子生物學(xué)鑒定差別較大，經(jīng)常被誤定為相同的種[9]。例如，東亞所特有的黃蓋鵝膏菌白色變種（Amanita subjunquillea var alba）[10]被誤認為是歐洲的鱗柄白鵝膏菌（Amanita virosa）。所以，在以形態(tài)特征為基礎(chǔ)的前提下，還需要輔以rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列（Internal Transcribed Spacer，ITS）和大亞基序列（Large Subunit，LSU）分析以及DNA中GC含量測定等分子生物學(xué)鑒定方法。

本研究在形態(tài)學(xué)分析的基礎(chǔ)上，利用PCR技術(shù)，擴增相應(yīng)的rDNA的ITS和LSU序列并連接在T載體上，進行DNA序列測定，通過GenBank進行同源性檢索比對，最后通過MEGA（version 5.1）軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，旨在為野生鵝膏菌的鑒定提供分子依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 供試鵝膏菌子實體采自山西左權(quán)縣。新鮮子實體采集后去除泥沙雜物，曬干至恒質(zhì)量。

1.1.2 主要試劑 DNA純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒（北京索來寶科技有限公司），PCR擴增試劑（北京全式金科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 子實體基因組DNA的提取及檢測方法 選取子實體中含有菌褶的菌蓋部分來提取DNA，提取方法采用SDS-CTAB法[11-12]，以提取的基因組為模板擴增得到目的基因，采用膠回收試劑盒進行基因組DNA純化。基因組DNA的檢測利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行。

1.2.2 rDNA的ITS和LSU基因序列的PCR擴增疑似鵝膏菌子實體ITS和LSU基因序列的PCR擴增分別使用的引物序列列于表1。

表1 用于PCR擴增的引物

ITS和LSU的PCR擴增反應(yīng)體系為：ddH2O 13 μL，10×Easy Taq Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 2.5 μL，10 μmol/L Forward primer/Reverse primer 引物各 2.5 μL，DNA 模板 2 μL，Taq DNA Polymerase 0.5 μL，總體積 25 μL。

擴增反應(yīng)在美國MJ Research公司生產(chǎn)的擴增儀上進行。擴增條件為：95℃預(yù)變5 min；95℃變性 30 s，55℃復(fù)性 30 s，72℃延伸 1 min，共 30個循環(huán)；最后于72℃保溫10 min。然后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR的擴增產(chǎn)物，采用上海復(fù)日科技有限公司的SDS凝膠成像系統(tǒng)攝取擴增圖譜。

1.2.3 rDNA片段克隆和測序 將擴增得到的目的基因連接到pEASY-Blunt Zero Cloning Vector載體上，轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細胞中，利用通用引物M13F/M13R進行菌落PCR篩選，得到陽性重組子，挑取陽性克隆交于北京六合華大基因生物技術(shù)有限公司進行DNA測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用MEGA（version 5.1）軟件中的最大似然法進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和分析，選擇系統(tǒng)發(fā)育樹中的自展值（bootstrap）為1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 對鵝膏菌子實體ITS和LSU的PCR擴增及測序

以鵝膏菌子實體的基因組DNA為模板，對其中的ITS和LSU片段進行PCR擴增，擴增結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，用引物ITS1/ITS4和LROR/LR5都成功地擴增出一條清晰的條帶，ITS序列長度為500～750 bp，LSU序列長度為750～1 000 bp。

2.2 rDNA ITS和LSU的測序及序列分析結(jié)果

由表2可知，山西左權(quán)鵝膏菌，ITS序列長度為666 bp，LSU序列長度為968 bp；ITS序列的GC含量為42.49%，LSU序列的GC含量為48.14%。一般認為，供試的rDNA序列與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫里序列BLAST比對后，序列相似性≥99%，可以認為屬于同一種；序列相似性在95%～99%，可以認為屬于相同屬；序列相似性≤95%，可以認為屬于不同的屬[13]。將鵝膏菌子實體得到的rDNA的ITS和LSU序列與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫進行檢索比對，確定與左權(quán)野生鵝膏菌最相似物種為擬橙蓋鵝膏菌。

表2 鵝膏菌子實體rDNA的ITS和LSU序列分析結(jié)果

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果分析

對疑似鵝膏菌子實體的ITS和LSU序列，連同從GenBank下載的相似序列一起進行系統(tǒng)發(fā)育分析。系統(tǒng)發(fā)育樹分支下方的數(shù)值為支持值（bootstrap），構(gòu)建得到的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2，3所示。

由圖2可知，將子實體的ITS序列連同Gen-Bank數(shù)據(jù)庫上下載的7個相似物種共8個ITS序列通過最大似然法做系統(tǒng)發(fā)育樹，山西左權(quán)鵝膏菌與其最相似物種（GenBank：LC056756）以 100%的支持率聚在一起。

從圖3可以看出，將子實體的LSU序列連同GenBank上下載的7個相似物種的LSU共8個序列用同樣的方法做系統(tǒng)發(fā)育樹，山西左權(quán)鵝膏菌與其最相似物種（GenBank：LC056746）以98%的支持率聚在一起。通過ITS序列和LSU序列做出的系統(tǒng)發(fā)育樹，鵝膏菌都以極高的支持率與擬橙蓋鵝膏菌聚在一起，所以將山西左權(quán)鵝膏菌初步鑒定為擬橙蓋鵝膏菌（Amanita caesareoides）。

3 討論

ITS和LSU序列常用來進行真菌鑒定，其中ITS稱為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，是真菌rRNA基因非轉(zhuǎn)錄區(qū)的一部分[14]。ITS的真菌鑒定序列包括ITS1，5.8S和ITS2區(qū)。由于ITS序列在關(guān)系密切的物種間的長度變化不大（高等真菌一般小于1 000 bp），而且序列在進化過程中速率較快，因此，ITS序列經(jīng)常用在屬及屬下水平做關(guān)于分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究[15-16]。LSU核糖體大亞基為核糖體大亞基序列，是位于28S的RNA序列。nLSU編碼核糖體大亞基廣泛用于真菌屬以下組分之間和高級分類成員間關(guān)系的研究[17]。本研究基于rDNA的ITS，LSU序列2個指標對來自山西左權(quán)的野生的疑似鵝膏菌進行分子鑒定。

通常使用的建樹方法分別是距離法、最大簡約法和最大似然法，理論上雖然最大似然法計算強度最大，但在系統(tǒng)發(fā)育分析方法中是最為有效的方法，所以本研究選用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。無論以ITS擴增片段還是以LSU擴增片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，均能準確地反映本試驗所鑒定野生菌株與擬橙蓋鵝膏菌最為相近。

擬橙蓋鵝膏菌（Amanita caesareoides）主要分布在我國、日本和俄羅斯遠東地區(qū)，在形態(tài)上類似于橙蓋鵝膏菌（Amanita caesarea）和紅黃鵝膏勤務(wù)（A－manita hemibapha）[19]。在分子分類鑒定中它們也常常聚在一起。2個系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果也都顯示與紅黃鵝膏（Amanita hemibapha）親緣關(guān)系最近，其中，rDNA的ITS序列以100%的支持率聚在一起；rDNA的LSU序列以98%的支持率聚在一起。Amanita caesareoides的菌蓋是血紅色至橙紅色，一般為70～125 mm；菌褶離生至近離生；而菌柄是淡黃色到黃橙色，有時帶有紅色或橙色的纖維或斑塊，其形狀為圓柱形，向上漸窄；菌托為囊狀、球狀至近球狀，其外表面為白色。Amanita caesareoides具有從近球形到橢圓形的孢子，與Amanita caesarea相比，其顏色非常明亮[20]。山西左權(quán)屬于太行山區(qū)，未曾見擬橙蓋鵝膏菌屬的報道，本研究是首次采到擬橙蓋鵝膏菌，通過形態(tài)學(xué)比較，結(jié)合分子生物學(xué)對其進行了鑒定。擬橙蓋鵝膏菌在太行山區(qū)的采集和鑒定，豐富了山西野生真菌資源。