劉麗敏 ，張東旭

（1.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西大同037009；2.山西大同大學(xué)設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，山西大同037009）

苦苣菜俗稱為野芥子、苦荬菜、苦菜、敗醬菜[1]，屬于菊科苦苣菜屬，在全國(guó)均有分布，易采摘，屬傳統(tǒng)食用野菜，不但可食用，還可入藥，有清熱解毒、消腫排膿、清肺止咳、益肝利尿等功效，其中，黃酮類(lèi)物質(zhì)是其主要的活性成分，是苦苣功能體現(xiàn)的物質(zhì)來(lái)源[2-5]。

本研究以山西大同市當(dāng)?shù)匾吧嘬臑樵?，利用微波輔助提取總黃酮，以期優(yōu)化提取工藝，為苦苣資源的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試苦苣于2016年5月中旬采于大同市近郊，切絲、干燥、粉碎，過(guò)0.42 mm篩，加石油醚脫脂、脫色后回收苦苣粉末，密封、避光保存。

1.2 試劑與儀器

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，無(wú)水乙醇，氫氧化鈉，石油醚，硝酸鋁，亞硝酸鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純；試驗(yàn)所用水均為蒸餾水。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000A，上海亞榮生化儀器廠）；紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV2800，上海尤尼柯有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6，國(guó)華電器有限公司）；電子分析天平（MP200B，上海天平儀器廠）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9140A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；組織搗碎機(jī)（JJ-2，江蘇億通電子有限公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（3-18KS，Sartorius-Sigma Centrifuges）；微波清洗器KQ-400KDE（天津奧特賽恩斯）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 稱取80℃下干燥至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g于100 mL容量瓶中，60%乙醇定容，得到0.1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液[6]。取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.00，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00 mL 分別置于6支25.00 mL容量瓶中，依次加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置5 min；加入10%A（lNO3）3溶液1 mL，搖勻，靜置5 min；然后加入4%的NaOH溶液10.00 mL，最后用60%的乙醇定容至25.00 mL，靜置15 min[7-10]。將靜置后的溶液于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、蘆丁溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝14.047x－0.012 8（R2＝0.994 1）。

1.3.2 單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn) 取處理好的苦苣粉末1.000 g于干燥燒杯中，分別對(duì)乙醇濃度（40%，50%，60%，70%，80%）、料液比（1∶15，1∶30，1∶45，1∶60，1∶75）、輻照時(shí)間（2，4，6，8，10 min）3 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取各因素的3個(gè)水平進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。

1.3.3 微波提取苦苣總黃酮 按試驗(yàn)設(shè)定的濃度和料液比加入乙醇溶液，混合均勻，靜置30 min后，密閉放入微波爐（功率800 W）進(jìn)行輻照[11]。為避免暴沸，每輻照1 min取出，冰水浴冷卻后，再放入微波爐重新輻照，累計(jì)至所需時(shí)間，濾去殘?jiān)孟鄳?yīng)濃度的乙醇定容至50 mL，搖勻即得黃酮提取液[12]。

1.3.4 總黃酮含量的測(cè)定 準(zhǔn)確吸取1.0 mL的提取液于25 mL容量瓶中，在510 nm處測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算總黃酮提取率[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響 由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，總黃酮得率達(dá)到最大值；超過(guò)60%時(shí)，總黃酮得率反而有所下降。這是由于隨著乙醇濃度的增加，在微波輻照的條件下，一些醇溶性雜質(zhì)溶出量增加，與黃酮類(lèi)化合物形成競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致黃酮類(lèi)化合物溶出減少。因此，提取濃度選擇60%乙醇為宜。

2.1.2 微波處理時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 由圖3可知，微波時(shí)間在2～6 min時(shí)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)總黃酮得率增大，微波時(shí)間超過(guò)6 min后，總黃酮得率反而減小。隨著微波輻照時(shí)間的增加，體系的溫度也不斷升高，這導(dǎo)致提取液中乙醇有效濃度降低的同時(shí)，苦苣中的非有效成分進(jìn)入提取液，不但影響有效成分的溶出，也降低總黃酮得率。所以，微波時(shí)間以6 min為宜。

2.1.3 料液比對(duì)總黃酮得率的影響 由圖4可知，隨著料液比增加，總黃酮得率增加，料液比為1∶60時(shí)，總黃酮得率最高，料液比再增加，總黃酮得率趨于穩(wěn)定。也就是說(shuō)，1∶60的料液比已能將有效成分基本溶出，綜合考慮溶劑用量、提取效果、經(jīng)濟(jì)成本，選用料液比1∶60為宜。

2.2 正交試驗(yàn)

通過(guò)3個(gè)單因素結(jié)果分析表明，黃酮含量受到乙醇濃度（A）、微波作用時(shí)間（B）、料液比（C）3個(gè)主要因素的影響，為研究各因素的綜合影響，設(shè)計(jì)3因素3水平L9（34）的正交試驗(yàn)，其結(jié)果如表1所示。方差分析顯示，乙醇濃度（A）、微波時(shí)間（B）、料液比（C）對(duì)黃酮得率的影響均達(dá)到了極顯著水平（表2），3種因素對(duì)黃酮得率的影響排序?yàn)镃＞A＞B。綜合考慮，確定最佳提取條件為A2B1C3，即乙醇濃度60%，微波時(shí)間4 min，料液比1∶60。

表1 苦苣總黃酮提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)方差分析

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

由2.2試驗(yàn)所確定的最佳工藝A2B1C3作驗(yàn)證試驗(yàn)，按1.3的步驟測(cè)其吸光度，并進(jìn)行黃酮得率的測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn) mg/g

在A2B1C3優(yōu)選工藝下，試驗(yàn)測(cè)得的總黃酮得率穩(wěn)定，且較正交試驗(yàn)中得率最高的處理5的得率有提高。

3 結(jié)論與討論

本研究正交試驗(yàn)確定微波輔助下苦苣菜總黃酮提取的影響因素重要性從大到小依次為料液比＞微波時(shí)間＞乙醇濃度。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)確定，微波法提取苦苣菜總黃酮的最優(yōu)工藝為：乙醇濃度60%、微波時(shí)間4 min、料液比1∶60，且在該提取條件下，苦苣菜總黃酮得率為23.80 mg/g。其誤差在正交試驗(yàn)結(jié)果允許范圍內(nèi)。微波輔助提取植物總黃酮的工藝操作簡(jiǎn)單，效率高，與有機(jī)溶劑浸提法、索氏提取法等傳統(tǒng)方法相比，在不降低提取率的同時(shí)，能節(jié)省投資，縮短了提取時(shí)間，操作簡(jiǎn)單、方便、快速，是一種比較理想的提取方法，有一定的參考意義和應(yīng)用價(jià)值[14]。