李永平，李 麗，梁 崢，賈民隆，曹冬梅

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，山西太原030031）

多倍體育種是培育植物新品種的一個(gè)重要途徑[1-6]。多倍體植物一般具有營養(yǎng)器官的巨大性[7]、植株抗性強(qiáng)、生長率高的優(yōu)點(diǎn)，而這些特點(diǎn)恰好都符合人們對(duì)觀賞植物的育種方向，因而多倍體育種在觀賞植物育種領(lǐng)域很受歡迎。

秋水仙素是一種常規(guī)的、應(yīng)用廣泛的多倍體育種誘變劑[8-10]，它對(duì)染色體結(jié)構(gòu)以及變異的影響很小[9]，同時(shí)能夠在細(xì)胞分裂中期阻礙紡錘絲形成，進(jìn)而中斷有絲分裂的過程[4]。然而，秋水仙素對(duì)植物材料和試驗(yàn)者的毒害作用是不容忽視的，尋找新型、廉價(jià)、低毒的的化學(xué)試劑或其他誘導(dǎo)方法替代秋水仙素是目前急需解決的問題。

大花萱草屬百合科萱草屬多年生宿根花卉，具有適應(yīng)性強(qiáng)、花大艷麗等優(yōu)點(diǎn)，具有很高的觀賞價(jià)值。目前，萱草育種以雜交手段為主，受季節(jié)限制一年只能進(jìn)行一次，雜交后代的繁殖量也很難迅速提升。山西省農(nóng)科院園藝研究所觀賞植物課題組曾采用秋水仙素作為誘導(dǎo)劑，成功地獲得了四倍體萱草[11]。

本試驗(yàn)在先前試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以萱草愈傷組織和不定芽為試材，氟樂靈為誘變劑，通過浸泡法和混培法探索萱草多倍體的誘導(dǎo)條件，旨在為萱草多倍體育種提供更多的可能性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所觀賞植物研究室培育的萱草雜交品種10-154（Hemerocallis fulva 10-154）組培苗。該品種為二倍體（2X＝22）。

1.2 試驗(yàn)方法

選擇生長健壯、帶有綠色芽點(diǎn)、組織緊密的愈傷組織，切取邊長0.5 cm左右的立方體小塊供試；選擇和分離生長健壯、長勢(shì)一致的不定芽供試。將2種材料分別用氟樂靈溶液處理，誘導(dǎo)方法包括浸泡和混培2種。

1.2.1 浸泡法 無菌條件下，將愈傷塊或不定芽浸入不同濃度（0，0.002%，0.006%，0.01%，0.03%）的氟樂靈溶液中，置于搖床上振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為80～100 r/min，分別于6，12，24 h時(shí)取出材料置于無菌操作臺(tái)上，用無菌蒸餾水沖洗4次，每次清洗5 min，待吸水紙吸干材料表面水分后置于分化培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)（分化培養(yǎng)基為MS＋6-BA0.1 mg/L＋KT 0.1mg/L＋NAA0.05mg/L＋蔗糖30g/L＋瓊脂5.3g/L，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照為5 000 lx，光照時(shí)間為 16 h/d）。

每組處理包括愈傷組織30塊，不定芽40個(gè)，重復(fù)3次。25 d后分別統(tǒng)計(jì)愈傷組織存活率及其上芽的生長系數(shù)、不定芽的存活率和增殖系數(shù)。將成活植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂5.3 g/L）中，20 d后統(tǒng)計(jì)誘變率。

1.2.2 混培法 將愈傷塊或不定芽材料分別接種至添加了不同濃度（0，0.001%，0.004%，0.007%，0.01%）氟樂靈的培養(yǎng)基上，3，5，7d后轉(zhuǎn)入不添加氟樂靈的正常分化培養(yǎng)基（MS＋6-BA0.1mg/L＋KT0.1mg/L＋NAA 0.05 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂5.3 g/L）中繼續(xù)培養(yǎng)（培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照 5 000 lx，光照時(shí)間16 h/d）。

每組處理包括愈傷組織30塊，不定芽40個(gè)，重復(fù)3次。25 d后分別統(tǒng)計(jì)愈傷組織的存活率及其上芽的生長系數(shù)、不定芽的存活率和增殖系數(shù)。將成活植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂5.3 g/L）中，20 d后統(tǒng)計(jì)誘變率。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

誘導(dǎo)所得材料的倍性鑒定采用染色體制片法[12]。切取再生植株的幼嫩根尖，放入對(duì)二氯苯飽和溶液中預(yù)處理5 h，蒸餾水清洗后在4℃的新鮮卡諾固定液處理22 h，然后進(jìn)行水洗，并轉(zhuǎn)入70%乙醇中備用。壓片前取出備用根尖，于60℃，1 mol/L鹽酸中解離8 min，卡寶品紅染色15 min，常規(guī)壓片，Nikon顯微鏡觀察、計(jì)數(shù)并照相。每處理統(tǒng)計(jì)15個(gè)細(xì)胞，以具有一致的染色體數(shù)作為該植株的染色體數(shù)目。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均經(jīng)鄧肯式新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸泡法處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

浸泡法處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響結(jié)果表明（表1），不同濃度的氟樂靈浸泡處理后，愈傷組織隨氟樂靈濃度的增大和處理時(shí)間的延長，存活率逐漸降低；不定芽增殖系數(shù)也隨氟樂靈濃度增大和處理時(shí)間的延長而呈降低的趨勢(shì)。當(dāng)氟樂錄濃度為0.002%時(shí)，愈傷組織的存活率在50.00%～94.44%，愈傷塊上不定芽的增殖系數(shù)受處理時(shí)間的影響不明顯，在1.86～2.10；當(dāng)氟樂靈濃度為0.006%時(shí)，愈傷組織的存活率明顯降低至25.00%～66.67%，其上不定芽的增殖系數(shù)與0.002%處理組差異不大；當(dāng)氟樂靈溶液濃度增大至0.01%～0.03%時(shí)，愈傷組織的存活率明顯下降，0.03%濃度處理24 h時(shí)，氟樂靈的毒害作用使存活率降至最低點(diǎn)（2.78%），同時(shí)愈傷組織分化不定芽的數(shù)量迅速減少，6 h時(shí)芽增殖系數(shù)僅為0.39，隨著時(shí)間的延長，出芽數(shù)量降至0。低濃度氟樂靈溶液的處理組合誘變率很低，0.002%濃度處理組誘導(dǎo)率均低于10%，隨著濃度的升高和處理時(shí)間的延長，誘變率逐漸提高，0.01%處理12 h的誘導(dǎo)率升至22.22%；但高濃度、長時(shí)間的處理組合又使愈傷組織的不定芽分化數(shù)減少，繼而導(dǎo)致誘變率處于低水平。最優(yōu)組合需要在獲得較高誘導(dǎo)率的同時(shí)保持較高的成活率，因此綜合考慮，浸泡法誘導(dǎo)愈傷組織染色體加倍試驗(yàn)的最佳處理組合為：0.01%氟樂靈處理12 h，此時(shí)成活率為41.67%，誘變率為22.22%。

表1 氟樂靈浸泡處理對(duì)萱草愈傷組織誘導(dǎo)多倍體的影響

2.2 浸泡法處理對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

用不同濃度氟樂靈溶液浸泡處理萱草不定芽的試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），不定芽存活率隨著氟樂靈濃度的增大和處理時(shí)間的延長逐漸降低。當(dāng)氟樂靈的濃度為0.002%時(shí)，存活率為40.00%～66.67%，不定芽增殖系數(shù)為1.65～2.13；當(dāng)氟樂靈濃度上升到0.006%時(shí)，不定芽的增殖系數(shù)為1.25～1.73，當(dāng)處理時(shí)間為24 h時(shí)，存活率僅為20%；當(dāng)氟樂靈濃度增至0.01%～0.03%時(shí)，氟樂靈的毒害作用顯著抑制不定芽的存活率，此時(shí)存活率降至0～33.33%。低濃度氟樂靈溶液的處理組合的誘導(dǎo)率很低，0.002%濃度時(shí)誘導(dǎo)率為1.11%～8.47%，隨著濃度的升高和處理時(shí)間的延長，多倍體誘導(dǎo)率明顯提高，在0.01%的濃度處理6 h后，誘導(dǎo)率達(dá)到21.75%；但高濃度、時(shí)間長的處理容易降低誘導(dǎo)率，當(dāng)氟樂靈濃度0.03%處理24 h時(shí)，其誘導(dǎo)率為0。綜合考慮，氟樂靈浸泡誘導(dǎo)不定芽染色體加倍試驗(yàn)以0.01%處理6 h組合效果較好，此時(shí)誘導(dǎo)率最高，為21.75%，成活率為26.67%。

表2 氟樂靈浸泡處理對(duì)萱草不定芽增殖的影響

2.3 混培法處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

混培法處理對(duì)萱草愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果表明（表3），隨著氟樂靈濃度的增大和處理時(shí)間的延長，萱草愈傷組織的存活率逐漸降低。當(dāng)氟樂靈的濃度為0.001%時(shí)，愈傷組織的存活率在60%～80%，其上不定芽的增殖系數(shù)為1.12～1.79。此時(shí)的存活率波動(dòng)幅度及其上不定芽的增殖系數(shù)波動(dòng)都不大，說明較低濃度的氟樂靈對(duì)萱草愈傷組織生長狀態(tài)的影響較??；當(dāng)氟樂靈濃度為0.004%時(shí)，愈傷組織的存活率在50.00%～58.33%，其上不定芽的增殖系數(shù)在0.86～1.21；當(dāng)氟樂靈濃度繼續(xù)上升到0.007%時(shí)，混培處理7 d的存活率迅速下降到30%，其上不定芽增殖系數(shù)也迅速減小至0.58；當(dāng)氟樂靈濃度達(dá)到0.01%、混培處理7 d時(shí)，氟樂靈的毒害作用加劇，使愈傷組織的存活率降至最低26.67%，其上不定芽的增殖系數(shù)為0.60。結(jié)果顯示，低濃度氟樂靈的處理組合對(duì)萱草愈傷組織的誘變作用很小，0.001%濃度處理組的誘導(dǎo)率僅為0～7.65%；隨著濃度的升高和處理時(shí)間的延長，誘導(dǎo)率明顯提高，0.007%濃度處理5 d的誘導(dǎo)率可達(dá)35.74%，同時(shí)高濃度、長時(shí)間的氟樂靈處理會(huì)導(dǎo)致誘導(dǎo)率的降低，這可能是由愈傷組織存活率低、產(chǎn)生不定芽的數(shù)量少導(dǎo)致的。綜上所述，氟樂靈混培法誘導(dǎo)愈傷組織染色體加倍試驗(yàn)的最優(yōu)組合為：0.007%處理5 d，此時(shí)愈傷組織成活率為50%，誘導(dǎo)率為35.74%。

表3 氟樂靈混培處理對(duì)萱草愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4 混培法處理對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明（表4），隨著氟樂靈濃度的增大和處理時(shí)間的延長，萱草的不定芽存活率逐漸降低。當(dāng)氟樂靈濃度為0.001%時(shí)，存活率從3 d的87.5%下降到7 d的65.0%，不定芽的增殖系數(shù)從2.10下降到0.95；當(dāng)氟樂靈濃度在0.004%時(shí)，不定芽的存活率在60.0%～72.5%，其增殖系數(shù)也呈現(xiàn)大幅下降的趨勢(shì)；當(dāng)氟樂靈濃度增大至0.007%時(shí)，不定芽的存活率為35.0%～67.5%；當(dāng)氟樂靈濃度為0.01%時(shí)，不定芽存活率為35.8%～50.0%，不定芽的增殖系數(shù)為0.41～0.61。低濃度氟樂靈的誘導(dǎo)率很低，本試驗(yàn)氟樂靈濃度為0.001%～0.004%的處理組合誘導(dǎo)率均低于10%；隨著濃度的升高和處理時(shí)間的延長，誘導(dǎo)率明顯提高，至氟樂靈濃度0.007%、處理時(shí)間7 d時(shí)，誘導(dǎo)率升高至13%。較高濃度較長時(shí)間的處理組合，存活率和誘導(dǎo)率均處于比較低的水平，氟樂靈濃度為0.01%時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率為3.04%～5.31%。綜上所述，氟樂靈混培誘導(dǎo)愈傷組織染色體加倍的最佳處理濃度為0.007%，最佳處理時(shí)間為7 d，此條件下，不定芽成活率為35%，誘導(dǎo)率為13%。

表4 氟樂靈混培處理對(duì)萱草不定芽增殖的影響

3 結(jié)論與討論

氟樂靈作為一種多倍體誘變劑，由于其毒性弱、價(jià)格低廉、誘導(dǎo)效果好，已在多種園藝植物上得到廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)中，若以愈傷組織作為外植體，萱草多倍體的誘導(dǎo)以氟樂靈濃度0.007%混培處理5 d的效果最好，成活率可達(dá)50%，誘導(dǎo)率達(dá)到35.74%；若以不定芽作為外植體，萱草多倍體的誘導(dǎo)以氟樂靈濃度0.01%浸泡處理6 h的誘變率最高，可達(dá)21.75%。前人的研究表明[13]，當(dāng)氟樂靈的濃度為180 μmol/L時(shí)，對(duì)南瓜幼嫩小苗的誘導(dǎo)率最高，完全可以代替誘導(dǎo)劑秋水仙素來誘導(dǎo)植株加倍。這與山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所觀賞植物課題組前期用秋水仙素混培處理萱草愈傷組織相比較，誘導(dǎo)率差異不大，但存活率明顯提高，從誘導(dǎo)時(shí)間上來看，氟樂靈誘導(dǎo)多倍體所需時(shí)間明顯低于秋水仙素處理時(shí)間[11]，秋水仙素在多倍體誘導(dǎo)過程中易造成染色體缺失，形成嵌合體[14-15]。因此，結(jié)合誘導(dǎo)率與死亡率、試驗(yàn)成本、對(duì)植物的傷害、周圍環(huán)境、人體健康多方面考慮，氟樂靈作為萱草多倍體誘導(dǎo)的有效試劑更為合適。

在本試驗(yàn)中，采用浸泡法和混培法誘導(dǎo)萱草多倍體植株，不同的誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)率也不同。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，采用氟樂靈作為誘導(dǎo)劑，選用混培法對(duì)外植體的傷害小，誘導(dǎo)率高，此結(jié)果與前人的研究結(jié)果略有不同[16-17]，這可能是由于材料不同、誘導(dǎo)部位不同，其還有待于進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。