許曉雙，張大為

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以HIV-1 IN-LEDGF/p75相互作用為靶點的抑制劑篩選

許曉雙，張大為

213001 常州，江蘇理工學院生物信息與醫(yī)藥工程研究所

晶狀體上皮源性生長因子 p75 蛋白（LEDGF/p75）與 HIV-1 整合酶（IN）之間的蛋白-蛋白相互作用是開發(fā)抗 HIV-1 藥物的有效靶點，本文旨在尋找以 HIV-1 IN-LEDGF/p75 相互作用為靶點的小分子抑制劑。

采用均相時間分辨熒光技術（HTRF）篩選了 799 個化合物，比對 IN-LEDGF/p75 相互作用的抑制活性。

發(fā)現(xiàn) 5 個化合物——腎上腺酮、6-溴-1,2-二氫萘-1,2-二酮、頭孢噻吩、根皮含柘樹呫噸酮 L 和迷迭香酸對該相互作用表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其 IC50值分別為 12.3、22.7、26.2、18.5 和 1.13 μmol/L。

為 HIV-1 IN-LEDGF/p75 相互作用抑制劑的發(fā)現(xiàn)以及新的抗 HIV-1 藥物的開發(fā)提供了重要基礎。

HIV 整合酶； HIV 整合酶抑制劑； LEDGF/p75； 均相時間分辨熒光技術； 蛋白-蛋白相互作用

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）是引起獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）的病原體。HIV 屬于逆轉錄病毒科（）慢病毒屬（），是一類潛伏期很長的病毒。人群中流行的 HIV 病毒主要有 2 種亞型：HIV-1 和 HIV-2。HIV-1 具有較高的毒力，更容易傳播同時也導致了全球大多數(shù)國家的 HIV 感染[1]。目前，針對該病毒缺乏有效的疫苗或者治愈手段，而針對病毒復制不同階段開發(fā)的化學治療藥物仍然是防治艾滋病的有效途徑[2]。

HIV-1 整合酶（integrase，IN）介導逆轉錄后形成的病毒 DNA 與宿主細胞基因組的整合，是病毒復制所必需的關鍵酶，也是研究抗艾滋病藥物的重要靶標[3]。目前，經(jīng)美國 FDA 批準上市的 IN 抑制劑有 3 個，包括雷特格韋（raltegravir，RAL）、埃替格韋（elvitegravir，EVG）和度魯特韋（dolutegravir，DTG），均為 IN 鏈轉移反應抑制劑（integrase strand transfer inhibitors，INSTIs）[4-5]。隨著 3 種 INSTIs 在臨床的應用，針對它們的耐藥性突變病毒株已經(jīng)出現(xiàn)[6]。因此，尋找新的作用機制靶點以開發(fā)新的 IN 抑制劑顯得尤為迫切和重要。

HIV-1 自身編碼的蛋白質數(shù)量有限，需要依賴宿主細胞蛋白及其信號通路完成自身復制。其中參與整合的宿主蛋白稱為整合輔因子（integration cofactors，INCFs）[7]。目前，研究最為清楚的 INCF 為晶狀體上皮源性生長因子 p75 蛋白（lens epithelium-derived growth factor，LEDGF/p75）[8]。LEDGF/p75 也是首個被發(fā)現(xiàn)的能與 HIV-1 IN 發(fā)生蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）的宿主蛋白。該 PPI 主要由 LEDGF/p75 蛋白 C 端 IN 結合區(qū)（integrase-binding domain，IBD）與 HIV-1 IN 催化核心區(qū)（catalytic core domain，CCD）作用形成，研究表明該蛋白-蛋白相互作用是開發(fā)抗 HIV-1 藥物的有效靶點[8]。

目前，盡管文獻已經(jīng)報道了許多 HIV-1 IN-LEDGF/p75 相互作用抑制劑，但還沒有一個該類抑制劑上市用于抗病毒治療。因此，積極尋找和設計新的 HIV-1 IN-LEDGF/p75 相互作用抑制劑，具有重要的臨床意義和廣闊的應用前景。本文以 HIV-1 IN-LEDGF/p75 相互作用為靶點，采用均相時間分辨熒光（homogeneous time resolved fluorescence，HTRF）技術，篩選了 799 個化合物抑制相互作用的活性，旨在尋找更多的 HIV-1 IN-LEDGF/p75 相互作用的抑制劑，為開發(fā)新的抗 HIV-1 藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒 大腸桿菌（）菌株 BL21（DE3）購自北京全式金生物技術有限公司；pMD-18-T 載體購自寶生物工程（大連）有限公司；表達載體 pET28a、pGEX-4T-1、重組質粒 pET28a-IN-dm（表達 N 端融合 6 × His 標簽含有 F185K/C280S 可溶型雙突變 IN）和 pGEX-4T-p75（表達 N 端融合 GST 標簽的 p75 蛋白）由本實驗室保存。

1.1.2 試劑與儀器 小分子化合物購自國家小分子化合物資源中心，其中399 個來自 InterBioScreen 公司（簡稱IB）的活性化合物庫，400 個來自 BioBioPha 公司（簡稱BBP）的結構類型多樣的天然產物庫；Ni-NTA 與 GST 純化柱填料購自常州天地人和生物科技有限公司；Anti-6His-XL665 受體磁珠和 Anti-GST-Cryptate 供體磁珠購自法國 Cisbio 公司；384 孔聚丙烯淺孔微孔板和 Envision 2102 multilabel reader 多功能酶標儀購自美國Perkin Elmer 公司；BE-9008 微孔板恒溫振蕩器購自其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 GST-IBD 的表達純化 以構建好的重組質粒 pGEX-4T-p75 為母本質粒，PCR 擴增 p75 IBD 結構域（第 347-429 為氨基酸殘基）表達序列，克隆至表達載體 pGEX-4T-1 的H I-I 位點。正確構建的含 p75 IBD 編碼基因的重組表達質粒命名為 pGEX-4T-IBD，然后轉化至BL21（DE3），培養(yǎng)過夜挑取單個克隆，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，按 1:100 的比例擴大培養(yǎng)至對數(shù)中期，0.5 mmol/L IPTG 30 ℃誘導表達 3 h，收集菌體。裂解液[50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2），500 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF]重懸菌體，超聲破菌，離心收集上清。利用GST 瓊脂糖凝膠 FF 親和色譜柱純化 LEDGF/p75融合蛋白。用洗脫 buffer[50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），500 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，20 mmol/L 還原型谷胱甘肽]洗脫目的蛋白，具體純化步驟參考文獻[9]。采用 SDS-PAGE 檢測蛋白表達純化，BCA 法測定蛋白質含量。

1.2.2 IN-HIS 的表達純化 以重組質粒 pET28a-N-IN-dm 為母本質粒，PCR 擴增 IN CCD 結構域（第 50-212 為氨基酸殘基）表達序列，克隆至表達載體 pET28a 的I-I 位點。正確構建的含 IN CCD 編碼基因的重組表達質粒命名為 pET28a-IN-CCD，然后轉化至BL21（DE3），培養(yǎng)過夜挑取單個克隆，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。按照 1:100 的比例擴大培養(yǎng)至對數(shù)中期，1 mmol/L IPTG 30 ℃誘導表達 4 h，收集菌體。裂解液[20 mmol/L HEPES（pH 7.3），1 mol/L NaCl，2 mmol/L β-ME，10% 丙三醇，0.1% NP-40]重懸菌體，超聲破菌，離心收集上清。利用 Ni-瓊脂糖凝膠 6FF 親和色譜柱純化 IN-HIS 融合蛋白。用洗脫 buffer[20 mmol/L HEPES（pH 7.3），1 mol/L NaCl，2 mmol/L β-ME，10% 丙三醇，250 mmol/L 咪唑]洗脫目的蛋白，檢測方法同 1.2.1。

1.2.3 基于 HTRF 的 IN-IBD 相互作用抑制劑的篩選方法 當 C-端帶有 His標簽的 HIV-1 IN（IN-HIS）和 N 端帶有 GST 標簽的 IBD（GST-IBD）蛋白相互作用時（空間距離小于10 nm），Anti-6His-XL665 受體磁珠和Anti-GST-Cryptate 供體磁珠也會相應靠近，從而發(fā)生共振能量轉移（FRET）現(xiàn)象[10]。供體磁珠熒光分子的激發(fā)將誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時供體熒光分子自身的熒光強度衰減。當抑制劑分子阻斷 IN-HIS 和 GST-IBD 的相互作用時，F(xiàn)RET 現(xiàn)象減弱。因此 FRET 現(xiàn)象的強弱可以反映抑制劑分子對兩個蛋白相互作用抑制作用的強弱，從而該方法可以用于 IN 與 IBD 相互作用抑制劑的篩選。

HTRF 實驗在 384 孔板進行，所用蛋白和化合物均用反應 buffer[25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），150 mmol/L NaCl，1 mg/ml BSA，0.1% NP40，2 mmol/L MgCl2]稀釋。將以下成分加入 384 孔板中：4 μl 50 nmol/L IN、4 μl 25 nmol/L IBD、2 μl 化合物，混勻后 25 ℃、200 r/min 反應 30 min。然后加入 5 μl 0.8 nmol/L 的 GST-Cryptate 供體磁珠和 5 μl 4 nmol/L 的 Anti-6His-XL665 受體磁珠（含 100 mmol/L KF），混勻后 25 ℃，200 r/min 反應 1 h。使用多功能酶標儀，以 320 nm 為激發(fā)光，讀取 665 nm 和 620 nm 處的發(fā)射光。以 BI-224436 作為陽性對照。

1.2.4 Z 因子的測定 為了評價所構建的 HTRF 篩選 GST-IBD 與 IN-HIS 相互作用抑制劑方法的質量與穩(wěn)定性，分別測定了 Z 因子、信號窗（signal window，SW）和 CV 等主要參數(shù)。當 Z 因子> 0.5、SW > 2、CV < 20% 時，該篩選方法的結果正確可信。此外，高通量篩選方法的信號噪音比（signal-to-ratio，S/N）> 10，信號背景比（signal-to-background，S/B）值> 3，該高通量篩選方法才具有高靈敏度和高特異性。Z 因子、S/N、S/B 的計算公式如下：

Z = 1 –3 ×（SDmax– SDmin） |Mmax– Mmin|

S/N =Mmax– Mmin SDmin

S/B =Mmax Mmin

Mmax：最大信號值的平均值；Mmin：最小信號值的平均值；SDmin：最小信號值的標準偏差；SDmax：最大信號值的標準偏差。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別計算各孔 665 nm 和 620 nm 處熒光強度的比值（Ration 665/620），并計算各孔的相對抑制率?；钚詷悠愤M行濃度稀釋后檢測相對抑制率，使用軟件 Graphpad 6.0 作圖計算半數(shù)抑制濃度 IC50值。

2 結果

2.1 GST-IBD 與 IN-HIS 的表達純化結果

圖 1A 為 GST-IBD 在大腸桿菌 BL21（DE3）中的表達結果，GST-IBD 在經(jīng) 0.5 mmol/L 的 IPTG 誘導后，目的蛋白（36.89 kD）蛋白量明顯增多，通過 GST 柱純化，并用 20 mmol/L 谷胱甘肽洗脫檢測得到 GST-IBD 蛋白，蛋白條帶清晰可見，沒有非特異性條帶，以 BSA 作為標準品，使用 BCA 法測得 GST-IBD 蛋白的濃度約為 0.28 mg/ml。

圖 1B 為IN-HIS 在大腸桿菌 BL21（DE3）中的表達結果，IN-HIS 在經(jīng) 1 mmol/L 的 IPTG 誘導后，蛋白（32.96 kD）表達量明顯增多，通過 Ni-NTA 柱純化，并用 250 mmol/L 咪唑洗脫檢測得到 IN-HIS 蛋白，蛋白條帶清晰可見，沒有非特異性條帶，以 BSA 作為標準品，使用 BCA 法測得 IN-HIS 蛋白的濃度約為 0.37 mg/ml。

2.2 HTRF 方法穩(wěn)定性分析

Z 因子、信號窗（SW）和 CV 是評價藥物篩選方法均一性和穩(wěn)定性的重要參數(shù)。如圖 2 所示，Z 因子、SW 值、CV 值分別為 0.89、21.05、4.09%，符合 Z 因子 > 0.5、SW > 2、CV < 20%，說明篩選結果是正確可信的；S/N 與 S/B 的值分別為 172.07 與 3.83，符合 S/N > 10，S/B > 3，說明該篩選方法具有高靈敏度和高特異性。

2.3 IB 庫中 IN-LEDGF/p75 抑制劑篩選結果

將 IB 庫中 399 個化合物進行抑制 IN-LEDGF/p75 活性篩選，每個化合物初篩體系終濃度為 50 μmol/L，重復 2 次。初篩結果顯示，化合物腎上腺酮（adrenalone）、6-溴-1,2-二氫萘-1,2-二酮（bonaphton）、頭孢噻吩（cefalotin）對 IN-LEDGF/p75 抑制活性均達到 90% 以上。將這 3 個化合物在反應體系中的終濃度以 50 μmol/L 作為起始濃度進行倍比稀釋，測定3 個化合物對 IN-LEDGF/p75 的抑制百分率，通過非線性擬合得到 IC50值（圖 3 ~圖 5）。結果顯示，腎上腺酮、6-溴-1,2-二氫萘-1,2-二酮、頭孢噻吩的 IC50值分別為 12.3、22.7和 26.2 μmol/L。

圖 1 SDS-PAGE 檢測 GST-IBD 與 IN-HIS 的表達純化結果[A：GST-IBD（M：分子量標準；1：上清；2：誘導后；3：誘導前；4：20 mmol/L GSH洗脫）；B：IN-HIS（1：誘導前；2：誘導后；3：上清；4：250 mmol/L 咪唑洗脫；M：分子量標準）]

Figure 1 Expression and purification results of GST-IBD and IN-HIS were detected by SDS-PAGE [A: GST-IBD (M: Marker;1: Supernatant; 2: After induction; 3: Before induction; 4: 20 mmol/L GSH elution); B: IN-HIS (1: Before induction; 2: After induction; 3: Supernatant; 4: 250 mmol/L imidazole elution; M: Marker)]

圖 2 HTRF 測試 GST-IBD 與 IN-HIS 相互作用方法評價結果

Figure 2 Evaluation results of GST-IBD and IN-HIS interaction by HTRF

2.4 BBP 庫中 IN-LEDGF/p75 抑制劑篩選結果

同樣，將 BBP 庫中 400 個化合物進行抑制 IN-LEDGF/p75 活性篩選，每個化合物初篩體系終濃度為 50 μmol/L，重復 2 次。初篩結果顯示，化合物根皮含柘樹呫噸酮 L（cudraxanthone L）與迷迭香酸（rosmarinic acid）對 IN-LEDGF/p75 抑制活性均達到 90% 以上。將這 2 個化合物在反應體系中的終濃度以 50 μmol/L 作為起始濃度進行倍比稀釋，測定 2 個化合物對 IN-LEDGF/p75 的抑制百分率，通過非線性擬合得出 2 個化合物對 IN-LEDGF/p75 抑制的 IC50值（圖 6 和圖 7）。結果顯示，根皮含柘樹呫噸酮 L 和迷迭香酸的 IC50值分別為 18.5 和 1.13 μmol/L。

圖 3 化合物腎上腺酮的 IC50（A）與化學結構式（B）

Figure 3 IC50(A) and chemical structure formula (B) of compound adrenalone

圖 4 化合物6-溴-1，2-二氫萘-1，2-二酮的 IC50（A）與化學結構式（B）

Figure 4 IC50(A) and chemical structure formula (B) of compound bonaphton

圖 5 化合物頭孢噻吩的 IC50（A）與化學結構式（B）

Figure 5 IC50(A) and chemical structure formula (B) of compound cefalotin

圖 6 化合物根皮含柘樹呫噸酮 L 的 IC50（A）與化學結構式（B）

Figure 6 IC50(A) and chemical structure formula (B) of compound cudraxanthone L

圖 7 化合物迷迭香酸的 IC50（A）與化學結構式（B）

Figure 7 IC50(A) and chemical structure formula (B) of compound rosmarinic acid

3 討論

HIV-1 IN-LEDGF/p75 蛋白之間的相互作用對于 IN 進入細胞核以及染色體定位是必需的，是篩選抗病毒藥物的重要靶點[8]。晶體結構顯示，二聚化的整合酶 CCD 形成的結合口袋與 LEDGF/p75 的 IBD 發(fā)生了相互作用。研究表明，抑制 CCD-IBD 相互作用的小分子化合物也能夠抑制它們各自全長蛋白，即 IN 和 LEDGF/p75 之間的相互作用。因此，本文采用全長的 IN 與 IBD 之間的相互作用來進行 IN-LEDGF/p75 之間的相互作用篩選。

腎上腺酮是兩棲綱、爬行綱、鳥綱和哺乳類中的嚙齒目動物的主要糖皮質激素，具有調節(jié)應激反應、免疫反應的功能。此外，腎上腺酮還是目前公認的心臟復蘇首選藥的合成前體[11]。6-溴-1,2-二氫萘-1,2-二酮是一種新的抗病毒化療藥物。研究表明，6-溴-1,2-二氫萘-1,2-二酮能明顯降低鼻內接種 A2 型流感（香港）68 病毒的小鼠的嚴重致死率[12]。頭孢噻吩臨床上作為耐青霉素金葡菌（耐甲氧西林者除外）所致的呼吸道感染、軟組織感染、尿路感染、敗血癥等的選用藥物[13]，可用于 AIDS 引起的細菌感染。根皮含柘樹呫噸酮 L 為氧雜蒽酮類化合物，廣泛存在于一些天然中草藥中，具有利尿、抗微生物、抗病毒、強心、抗結核、抗癌、抗肝毒等藥理活性[14]。目前未見關于這 4 個化合物具有抑制 IN-LEDGF/p75 相互作用的活性的報道。因此，本研究首次報道了這 4 個化合物具有抑制IN-LEDGF/p75 相互作用的活性。

迷迭香酸廣泛分布于唇形科、紫草科、葫蘆科等植物資源中，具有抗菌消炎、抑制 HIV 整合酶、抑制透明質酸酶、抗抑郁、抗血栓、抗腫瘤等藥理作用[15]。Tewtrakul 等[16]發(fā)現(xiàn)，提取于紫蘇的迷迭香酸在體外抑制 HIV-IN 活性的 IC50值為5 μmol/L，而本文發(fā)現(xiàn)迷迭香酸在體外抑制 IN-LEDGF/p75 相互作用的 IC50為 1.13 μmol/L，表明迷迭香酸是一種蛋白-蛋白相互作用抑制劑，為發(fā)現(xiàn) HIV-1 IN-LEDGF/p75 相互作用抑制劑提供了重要基礎。

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Screening of inhibitors targeting HIV-1 IN-LEDGF/p75 interaction

XU Xiao-shuang, ZHANG Da-wei

Institute of Bioinformatics and Medical Engineering, Jiangsu University of Technology, Changzhou 213001, China

The protein-protein interaction between the cellular chromatin associated protein lens epithelium-derived growth factor (LEDGF/p75) and the HIV-1 integrase (IN) is an effective target for the development of anti-HIV-1 drugs. This work aims to find small molecular inhibitors targeting the HIV-1 IN-LEDGF/p75 interaction.

The inhibitory activity of 799 compounds (from 2 compounds libraries: InterBioScreen and BioBioPha) on the interaction of IN-LEDGF/p75 was screened by a homogeneous time resolved fluorescence (HTRF)-based assay.

It was found that five compounds, adrenalone, bonaphton, cefalotin, cudraxanthone L and rosmarinic acid, showed different inhibitory effect on the interaction of HIV-1 IN-LEDGF/p75, and their IC50values were 12.3, 22.7, 26.2, 18.5 and 1.13 μmol/L, respectively.

This work provides an important basis for the discovery of HIV-1 IN-LEDGF/p75 interaction inhibitors and the development of new anti-HIV-1 drugs.

HIV integrase; HIV integrase inhibitors; LEDGF/p75; Homogeneous time resolved fluorescence; Protein-protein interaction

ZHANG Da-wei, Email: zhangdw517@gmail.com

國家自然科學基金（31700297）

張大為，Email：zhangdw517@gmail.com

2018-07-09

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.003