王鵬 郭世炳

作者單位：010059 呼和浩特，內蒙古醫(yī)科大學研究生學院 ( 王鵬 )；010030 呼和浩特，內蒙古醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 ( 郭世炳 )

骨肉瘤 ( osteosarcoma，OS ) 是青少年最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，它好發(fā)于長骨的干骺端，而股骨遠端和脛骨近端的發(fā)病率占其 50%。其每年發(fā)病率為 3 / 100 萬，其中男女比例為 1∶1.4[1-2]。OS 易通過血液轉移到其它器官，尤其肺部。少數(shù)情況下可轉移到大腦、前列腺和其它組織[3-4]。新輔助化療聯(lián)合手術已成為治療 OS 的主要治療方式，常用的新輔助化療藥物包括順鉑 ( DDP )、阿霉素 ( ADM )、甲氨蝶呤 ( MTX ) 和異環(huán)磷酰胺 ( IFO )[5]。隨著新輔助化療的開展，OS 患者 5 年生存率已從 20% 提高至 75%，轉移率和病死率已得到很大程度降低。但由于不同個體之間 OS 細胞對化療藥物的敏感性不同而使化療效果并不理想，并且隨著藥物長時間的使用，OS 患者會產生化療耐藥[6]。由于化療耐藥的產生會導致疾病的復發(fā)和轉移，這就對 OS 患者化療之后的臨床療效提出了挑戰(zhàn)。研究報道 OS 的化療耐藥是由多水平、多因素、多基因和多信號通路參與調控的復雜過程，其中包括線粒體改變、DNA 修復、細胞自噬、上皮間質轉化 ( EMT )、miRNA 調控等[7]。近期研究發(fā)現(xiàn)自噬、microRNA 和 OS 化療耐藥性形成密切相關。因此筆者將通過“Osteosarcoma”、“Chemoresistance”、“Autophagy”、“microRNA”等作為關鍵詞，利用計算機檢索數(shù)據(jù)庫 Pubmed 和 EMBASE，重點回顧關于自噬、microRNA 在 OS 發(fā)生及化療中作用研究進展，以進一步揭示 OS 化療耐藥產生以及發(fā)展的潛在分子機制。現(xiàn)報告如下。

一、自噬

自噬是一種細胞自我吞噬的代謝途徑，它通過降解和回收細胞內受損的細胞器、長期存在和錯誤折疊的蛋白質，來維持細胞內穩(wěn)態(tài)和正常的細胞功能[8]。除了維持細胞再生的正常生理狀態(tài)外，自噬也參與多種病理過程，包括腫瘤進展及耐藥性、代謝紊亂、神經退變與肺部疾病等[9]。

1. 自噬過程概述：激活自噬過程的信號通常來自不同的應激條件，如饑餓、缺氧、氧化應激、蛋白質聚集等。這些信號通路的共同靶點是 ULK1 復合物 ( 包括 ULK1、ATG13、FIP200 和 ATG101 )，同時誘導 Beclin1 和 Bcl-2的磷酸化來促進 PI3K 復合物 III ( 包括 PI3K、VPS34、Beclin1、ATG14、AMBRA1、p115 ) 的形成。這兩種復合物對于形成吞噬泡是必需的，該吞噬泡是一種雙層膜結構，其可延伸成囊泡 ( 自噬體 )。接下來可以局部激活PI3P 中的 ER 結構，PI3P 進而通過其結合域可與 PI3P 受體蛋白 WD ( WIPI2 和 DFCP1 ) 結合[10]。最近研究表明WIPI2 可直接與 ATG16L1 結合，從而吸引 ATG12-ATG5-ATG16L1 復合物的形成，可增強了 ATG3 介導的 ATG8 家族蛋白 ( ATG8s ) 的表達，進而促進膜結合形成脂質體。ATG8 家族蛋白不但能夠吸引合成自噬相關的因子而且滿足了吞噬泡隔離膜的延長及關閉[11]。在 ATG4、ATG7 和ATG3 的作用下，LC3 轉變?yōu)?LC3-II-PE 并緊密結合于吞噬泡隔離膜表面，吞噬泡隔離膜最終被封閉成雙膜囊泡，形成自噬體。一些生物膜 ( 質膜、線粒體和高爾基復合物 ) 可促進自噬體膜的延伸，部分脂質雙層由 ATG9 含有的囊泡提供，但其余脂質雙層膜的來源目前尚不清楚。在大多數(shù) ATGs 的清除和微管傳遞到溶酶體后，自噬體的外膜與溶酶體膜融合形成了自噬溶酶體。這種融合最終可將一個單膜自噬體釋放到溶酶體腔內從而形成水解環(huán)境，然后通過這個環(huán)境自噬溶酶體可將自噬體與它的產物一起降解[12]。

2. 自噬與 OS 化療耐藥：目前，自噬在 OS 中的作用仍然存在爭議。一方面，自噬可作為細胞管家清除受損的細胞器并且保護細胞防止癌變。另一方面，過度或持續(xù)的自噬被證明可通過增強誘導細胞凋亡的進程或形成“自噬性細胞死亡”來促進腫瘤細胞死亡[13]。自噬還可在應激反應中作為一種促進細胞存活的信號，例如在饑餓、缺氧和存在化療或靶向治療的條件下，它可能在中晚期腫瘤患者中介導化療耐藥。研究發(fā)現(xiàn)微管相關蛋白 1 輕鏈 3I、II ( LC3I、 LC3II ) 在化療耐藥 OS 細胞中的陽性表達率明顯高于正常骨組織，Liu 等報道了高遷移率族蛋白 1( HMGB1 ) 可通過與自噬相關基因 Beclin1 結合參與了 OS細胞自噬和化療藥物耐藥性形成，因此自噬與 OS 化療耐藥存在著明顯的量效關系[14]。

( 1 ) 自噬誘導了 OS 化療耐藥：近年來，越來越多的證據(jù)表明，自噬在化療耐藥的發(fā)展中起著關鍵作用。當細胞遭受到化療藥物時，細胞自噬通過引發(fā)自噬體的形成來降解細胞受損細胞器或顆粒生成氨基酸和脂肪酸。細胞應激或代謝需求的增加可激活自噬，這樣可促進腫瘤細胞存活，導致腫瘤生長和化療耐藥的產生[15]。研究表明紫杉醇可導致了骨肉瘤 U-2OS 細胞中 STMN1 表達的上調，導致了自噬的活化。研究者敲除 STMN1 發(fā)現(xiàn)紫杉醇誘導自噬明顯減少，對于 OS 細胞的化療敏感性明顯增強[16]。已經有研究報道在 DDP 治療 OS 中，耐藥與增強保護自噬、減弱細胞凋亡呈正相關。對于 AMPK 依賴的自噬，DDP通過激活 NFKB1 / NF-κB 自噬通路來誘導 GFRA1 表達，進而導致 OS 耐藥[17-18]。自噬相關基因 ATG4 是一種兩共軛系統(tǒng)調節(jié)器，它可以誘導 ADM 介導自噬囊泡的形成，進而增強自噬而導致化療耐藥。而 miR-101 可通過下調ATG4 的表達，進一步抑制自噬來增強 OS 化療藥物的敏感性[19]。

( 2 ) 自噬增加了 OS 化療敏感性：在人骨肉瘤 U-2OS細胞中，黃酮類化合物通過上調自噬相關基因 Beclin1 增強了 ADM 誘導自噬，導致 U-2OS 細胞死亡，從而揭示了協(xié)同細胞毒作用[20]。DSTD 是一種新型的雄烯二酮衍生物，在 MG-63 和 U-2OS 細胞中，它可以抑制巨噬細胞遷移抑制因子 ( MIF ) 表達。DSTD 通過誘導 Bcl-2 的下調和HMGB1 轉運來抑制 MIF 的表達，從而增強自噬。DSTD還可通過下調 HMGB1 水平來增強化療敏感性，進一步克服 OS 耐藥[21]。此外，自噬中還調節(jié)著兩共軛系統(tǒng)。VOA是從植物提取出來的生物堿，是一種自噬誘導劑。在野生型和多藥耐藥 ( MDR ) 腫瘤細胞中，它可以通過促進 LC3表達和轉換來增強自噬，并通過促進腫瘤細胞凋亡來增加化療敏感性[22]。在人 OS 細胞中，2-甲氧雌二醇 ( 2-ME )治療與自噬體形成密切相關。它可以誘導 LC3-I 向 LC3-II 轉換并調控著 Atg7 的表達。因此，自噬在 2-ME 介導的抗 OS 中發(fā)揮重要作用[23]。

二、microRNA 與 OS 化療耐藥

直到 21 世紀初，微小 RNA ( microRNAs ) 的功能作用還沒有被完全闡明。在過去的 20 年中隨著精確的 RNA 測序技術的出現(xiàn)，miRNA 已經被證明幾乎可以調節(jié)所有細胞過程。它可以通過轉錄后調節(jié)大多數(shù)蛋白質編碼基因與大量的非編碼基因。在腫瘤中，miRNAs 已被證明在細胞分裂、自我更新、侵襲和 DNA 損傷中發(fā)揮關鍵作用[24]。microRNA ( miRNA ) 是一種含有 22～24 個核苷酸單鏈非編碼 RNA，它存在于非編碼區(qū)域[25]。作為一種 mRNA 的調節(jié)器，它參與調節(jié)細胞增殖、基因表達、甚至個體發(fā)育的整個過程[26]。miRNA 不僅在生物學上影響衰老的過程、能量供應、血管生成、EMT、增殖，遷移，侵襲，轉移和細胞凋亡，而且在各種腫瘤中，它在遺傳或表觀遺傳學發(fā)揮雙重作用 ( 抑制 / 促進癌癥 )。據(jù)報道，已經在人類的許多腫瘤中發(fā)現(xiàn)了 miRNAs 異常表達，包括腎癌、結腸癌、肺癌、惡性膠質瘤、胃癌[27]。最近的研究表明，在 OS 細胞中也發(fā)現(xiàn)許多 miRNAs 的異常表達，它在 OS 產生和發(fā)展過程中起到了一個原癌基因或者抑癌基因的作用[28-29]。最近研究發(fā)現(xiàn)在 OS 中 miR-498-3p 的缺失可刺激 PAX3-MET 表達引起腫瘤轉移[30]。miR-491-5p 和miR-192 過表達能夠抑制 OS 細胞增殖。此外，miRNAs 不僅對 OS 有直接的調節(jié)作用，而且也可以影響化療的敏感性[31-32]。micRNA-140 是首先報道的與 OS 化療藥物敏感性有關的 miRNA 分子[33]。Song 等[34]通過研究證實：在攜帶 wt-p53 的 U2-OS 及 MG-63 骨肉瘤細胞系中，一方面，miRNA-140 的過表達可通過誘導 p53 和 p21 的表達導致G1 和 G2 期阻滯，抑制腫瘤細胞的增殖速度；另一方面，上調 miRNA-140 的表達可導致腫瘤細胞對 MTX 及 5-氟尿嘧啶等化療藥物的耐藥性。因此，miRNAs 與 OS 化療耐藥密切相關。

1. microRNA 增加了 OS 化療敏感性：化療后 miRNAs的表達水平與正常骨細胞相比較可出現(xiàn)明顯的增加或減少。目前已經發(fā)現(xiàn) OS 細胞系相比較正常骨細胞中存在miR-21，miR-138，miR-33b，miR-29b-1，miR-143，miR-497 和 miR-15a 的低表達[35-41]。當這些 miRNAs 過表達時，OS 細胞將呈現(xiàn)出對化療藥物的高度敏感性。它主要是通過抑制腫瘤細胞增殖、自噬作用及促進細胞凋亡來促進藥物抗腫瘤的作用。此外，在化療后的 OS 細胞中可能會檢測到 miR-22 和 miR-217 基因表達水平降低，它們的高表達會增加化療藥物的敏感性[42-44]，這可能是由于化療藥物誘發(fā) OS 細胞去抑制 miRNAs 在抗腫瘤作用的表達，進而導致 OS 細胞化療耐藥的產生。但化療耐藥可能由于這些 miRNAs 過表達而被反轉。人們從這一觀點出發(fā)，發(fā)現(xiàn)上調一些 miRNAs 之后可以增加 OS 化療的敏感性，例如 miR-15a、miR-101、miR-33a、miR-301a、miRNA-202[19,41,45-47]( 表 1 )。

表1 miRNA 增加對化療藥物敏感性基礎研究Tab.1 Increased miRNAs chemosensitivity to anti-tumor drugs

2. microRNA 誘導了 OS 化療耐藥：與正常骨細胞或化療后的 OS 細胞相比，在 OS 中與化療相關的 miRNA 水平是有突變的。與正常骨細胞或組織相比，OS 細胞中 miR-221、miR-33a、miR-301、miR-202、miR-488、miR-367和 miR-146b-5p 的水平更高，這表明這些 miRNAs 可能會對腫瘤的增殖有促進作用[59-61]。將這些 miRNA 轉染入 OS細胞，可以通過促進增殖、侵襲和轉移來保護細胞免受腫瘤藥物的侵襲，進而導致化療藥物耐藥的產生。在化療耐藥的 OS 細胞中，可見 miR-146b-5p 和 miR-184 表達水平的上調，進而抑制細胞凋亡來產生化療耐藥[61-62]。此外，OS 細胞中 miR-21 和 miR-193a-5p 的上調也顯示 OS 化療的耐藥性[35,63]( 表 2 )。

三、microRNA 調控自噬相關因子與 OS 化療耐藥

表2 miRNA 增加對化療藥物的耐藥基礎研究Tab.2 Decreased miRNAs chemosensitivity to anti-tumor drugs

1. 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 ( mTOR )：磷脂酰肌醇3-激酶 ( PI3K ) / 蛋白激酶 B ( Akt ) 是調控細胞自噬的重要信號通路 ( 以下簡稱 PI3K / Akt ) ( 圖 1 )。這條通路可以激活許多下游目標，如 mTOR。mTOR 具有調節(jié)細胞生長和增殖作用，也是自噬啟動階段的關鍵調節(jié)因子，活化后可抑制自噬發(fā)生[70]。啟動階段的靶點主要為 mTOR 相關靶點，包括 TOR 復合體 1 和 I 型 PI3K，激活 I 型 PI3K 從而觸發(fā) mTOR 通路是必不可少的環(huán)節(jié)，因而通過調節(jié) I 型PI3K 便可以調控自噬[71]。PTEN ( 磷酸酶和張力蛋白同源物 ) 是一種具有蛋白酶和磷酸酶雙重活性的抑癌基因，可作為 PI3K / Akt 信號通路的主要負調控因子。近期有研究報道 MiR-155 通過靶向抑制 PTEN 的表達來增強 PI3K /Akt / mTOR 信號通路，抑制 ADM 誘導的 OS 細胞自噬和凋亡，降低對其的敏感性[72]。塞來昔布是一種環(huán)氧化酶-2 ( COX-2 ) 抑制劑，它在下調 PI3K / Akt 在多藥耐藥基因 MRP1，BCRP and Trkb，E-cadherin，β-catenin 的調節(jié)中起重要作用。在骨肉瘤 MG-63 細胞系中，它可通過下調 PI3K / Akt 誘導細胞凋亡，進而增強對 DDP 化療的敏感性[73]。

2. 高遷移率族蛋白 ( HMGB )：HMGB 家族是一組高度保守并且包含 HMG 盒結構域的蛋白家族。HMG 盒是一種新型的 DNA 結合基序，其特征是三個α螺旋排列成L 形。HMGB1，位于人類染色體上 13q12-13，是一類具有兩個串聯(lián)的 HMG 盒域 ( A 盒和 B 盒 ) 和一個酸性 C-末端的非組蛋白染色體結合蛋白[74]。當受到各種內源性和外源性刺激時，HMGB1 會迅速地從細胞核向細胞質移動或被釋放到細胞外，HMGB1 可作為信號分子競爭性結合Beclin-1，通過控制 Beclin1-Bcl-2 復合體解離調節(jié)自噬進程。HMGB1 也可結合到細胞表面受體，激活下游信號通路刺激細胞增殖遷移，進而誘導自噬的發(fā)生[75]。Huang等[76]發(fā)現(xiàn) HMGB1 不僅會在 OS 化療過程中呈高表達，而且在 OS 化療過程中會調節(jié)自噬。HMGB1 被抑制會增加化療敏感性。相反，HMGB1 過表達會增加對化療的耐藥性。這些發(fā)現(xiàn)都證實了 HMGB1 是自噬介導細胞存活的重要調節(jié)因子。事實上，Guo 等[42]已經提出在 OS 細胞中，HMGB1 作為 miR-22 的直接靶點，miR-22 可下調 HMGB1介導的自噬來進一步增強化療的敏感性。HMGN5，是一種普遍存在的核蛋白，廣泛表達于真核生物中。研究者在 OS 細胞中檢測到了 HMGN5 基因 mRNA 和蛋白的高表達。研究表明，miR-140-5P 通過轉錄激活核小體上調HMGN5，導致 OS 細胞株 U2-OS 和 MG6319 產生耐藥。因此，HMGB 誘導自噬對 OS 產生的耐藥具有重要意義，是腫瘤治療的新靶點[77]。

圖1 miRNA 調控自噬相關因子在骨肉瘤化療耐藥的分子機制假說Fig.1 The molecular mechanism of miRNA regulating the autophagy related factors in chemotherapy resistance of osteosarcoma

3. 其它自噬相關因子：Beclin-1 是首個被發(fā)現(xiàn)的哺乳動物自噬基因，已經被確認可結合 VPS34 ( III 類磷酸肌醇 - 3 - 羥基激酶 ) 來驅動自噬體的形成。它通過結合 PI3KCIII / Vps34 調節(jié)自噬的產生。已經有研究表明Beclin-1 介導的自噬可以導致 OS 化療耐藥，miR-30a 可結合 Beclin-1 的 3’UTR 區(qū)。進一步研究在骨肉瘤 MG-63細胞中，miR-30a 的下調可增加 Beclin-1 介導的自噬，進而導致 ADM 耐藥[78]。ATG16L1 是一個大蛋白復合體的組成部分，而這個大蛋白復合體又是產生自噬必不可少的。目前，研究表明在 OS 細胞系和組織中存在 miR-410 表達下調，ATG16L1 作為 mir-410 的一個潛在的靶基因。而miR-410 通過調節(jié)自噬相關基因 ATG16L1 表達來抑制自噬，進而增強 OS 化療藥物的敏感性[79]。

四、展望

本綜述詳細闡述了自噬、miRNA 與 OS 化療耐藥的相互關系，并且分別說明了自噬與 miRNA 的改變與 OS 化療敏感性與耐藥性的相互作用機制。在 OS 中，miRNA 已被證實參與自噬的各個階段，包括吞噬細胞誘導、成核和擴增，自噬體和自體溶酶體成熟，并發(fā)揮調控作用以及介導著 OS 化療敏感性。隨著 miRNA、自噬在 OS 化療耐藥方面研究的逐步深入，許多抗腫瘤藥物已被研制來進一步對抗化療耐藥，其中新型靶向治療包括通過抑制 PI3K / Akt /mTOR 通路來逆轉自噬并抑制化療耐藥。多項研究證實抑制 PI3K / Akt / mTOR 自噬通路是一種克服化療耐藥、增強抗腫瘤敏感性的方法，且該通路相關研究的有效性和臨床試驗的安全性已被證實。除了腫瘤活檢外，miRNA 還可能在包括血液，尿液，唾液等在內的任何身體流體中檢測到。因此，miRNA 在 OS 中的重要且直接的用途是利用其標記疾病。除了早期準確診斷疾病外，miRNA 還可以用于跟蹤 OS 患者的化學治療的預后及復發(fā)的情況。

然而，根據(jù)有限的文獻報道，現(xiàn)階段在 OS 化療耐藥的發(fā)展中對于細胞自噬、miRNA 始終存在著爭議。OS 化療耐藥的研究尚處于起步階段，許多具體的作用機制還需進一步深入研究。目前，化療耐藥性仍是影響 OS 患者的生存率的最大障礙。明確 OS 化療耐藥機制，并且能夠找到相應的處理辦法，這樣才能提高 OS 患者的生存率。因此研究 OS 化療耐藥機制對于研發(fā)新型化療藥物和提高 OS患者的生存率都有著十分重要的價值。