王學(xué)坤， 苑庭剛， 王逸群

(1.安徽師范大學(xué) 體育學(xué)院，安徽 蕪湖 241003；2.國家體育總局 體育科學(xué)研究所 北京 100763)

肥胖主要是因脂肪在機(jī)體內(nèi)的大量堆積所造成。而肥胖導(dǎo)致的糖脂等代謝紊亂是心腦血管疾病、2型糖尿病等疾病的重要誘因[1-3]。有氧耐力運(yùn)動被普遍認(rèn)為是改善血脂的有效運(yùn)動形式[4]。長時間耐力運(yùn)動中機(jī)體能耗需求增加，脂肪動員供能增加，使得甘油三酯、內(nèi)源性甘油三酯和膽固醇合成下降[4]。研究亦證實(shí)，持續(xù)鍛煉可使肥胖小鼠血液總膽固醇和低密度脂蛋白(LDL)含量下降，并使得高密度脂蛋白(HDL)水平增加[5,6]。但是目前體育科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)，探究不同強(qiáng)度有氧耐力運(yùn)動影響肥胖小鼠血清及組織器官各代謝酶活性的相關(guān)研究還較少。Hu等報道有氧游泳訓(xùn)練通過調(diào)節(jié)脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)與合成以及β-氧化有關(guān)酶基因的表達(dá)預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝病發(fā)生[7]，Aoi等進(jìn)一步報道了有規(guī)律的鍛煉通過上調(diào)脂肪分解關(guān)鍵酶基因如肉堿-脂酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、脂酰輔酶A脫氫酶等在肝臟中的表達(dá)，增強(qiáng)脂肪的氧化分解，從而可有效預(yù)防由高糖飲食誘導(dǎo)的脂肪肝發(fā)生[8]，Sampedro-Piquero等研究提示耐力運(yùn)動可使大腦的細(xì)胞色素氧化酶活性增強(qiáng)[9],Tomiga等最新研究發(fā)現(xiàn)小鼠運(yùn)動訓(xùn)練可增強(qiáng)其大腦皮層一氧化氮合成酶的表達(dá)從而可能是實(shí)現(xiàn)肥胖小鼠減肥的中樞機(jī)制之一[10]。由于生物體的一切代謝都是酶促反應(yīng)，因此運(yùn)動減肥勢必會涉及到代謝酶類活性的改變。為了對運(yùn)動減肥的機(jī)制有一個比較深入的了解，本研究利用不同強(qiáng)度的有氧耐力運(yùn)動對肥胖小鼠進(jìn)行運(yùn)動干預(yù)，研究小鼠糖代謝、脂代謝、脂蛋白代謝與轉(zhuǎn)化、能量代謝等某些重要酶活性的變化，旨在為運(yùn)動減肥的理論研究及其推廣提供較全面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并從分子水平進(jìn)一步闡明運(yùn)動減肥的部分機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

90只6周齡雄性昆明系小鼠,體重(19.02±2.15g),購自南京青龍山實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常飼料對照組(NC組)、高脂飼料對照組(HC組)、運(yùn)動大組1(為有氧耐力運(yùn)動+高脂飼料組，根據(jù)游泳時長又設(shè)短、中、長3組，分別為HES1、HEM1、HEL1)、運(yùn)動大組2(為有氧耐力運(yùn)動+正常飼料組，同樣根據(jù)游泳時長分為短、中、長3組，分別為HES2、HEM2、HEL2)，除NC和HC分別為15只外，其余各組均為10只。動物基礎(chǔ)飼料和高脂飼料(配方：在基礎(chǔ)飼料中加入2%膽固醇、20%豬油、0.5%膽酸鈉。)均購于南京青龍山實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場。

1.2 試劑和儀器

甘油三酯測定試劑盒、膽固醇測定試劑盒、高密度脂蛋白-膽固醇測定試劑盒皆購于上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司，溶血磷脂酶購于Sigma產(chǎn)品，細(xì)胞色素氧化酶(CCO)測定試劑盒、檸檬酸合酶(CS)測定試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，長鏈羥脂酰輔酶A脫氫酶(HACD)測定試劑盒購于上海寶曼生物科技有限公司，脂蛋白脂酶(LPL)測定試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，其它所有試劑皆為分析純。HITACHI7020型全自動生化分析儀，Multiskan FC酶標(biāo)儀，752型紫外可見分光光度計(jì)(購于上海分析儀器廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

NC組小鼠利用基礎(chǔ)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，其余各組均采用高脂飼料進(jìn)行高血脂小鼠造模。8周后，在NC和HC組隨機(jī)各取小鼠5只，禁食18h，摘除小鼠眼球取血，血液在3200r/min條件下，離心10min，取血清測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量。造模成功后，運(yùn)動組HES1、HEM1、HEL1以及HES2、HEM2、HEL2進(jìn)行無負(fù)重游泳運(yùn)動，NC和HC組不參加運(yùn)動。

運(yùn)動組在長120cm、寬60cm、高60cm的玻璃缸中(靜水深32cm，水溫29～32℃)。運(yùn)動組小鼠每天游泳1次,第1周HES組為10min，HEM組為20min，HEL組為30min；第2周HES組為20min，HEM組為30min，HEL組為40min；第3周、第4周各運(yùn)動組游泳時間依此遞增，每周6d，休息1d。小鼠末次游泳訓(xùn)練后，所有小鼠禁食18h，同樣摘除小鼠眼球取血，血液在3200r/min條件下，離心10min，取血清測定TC、TG、HDL-C、LDL-C含量。同時，分別取適量血清測定血清卵磷脂膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶(LCAT)、檸檬酸合酶(CS)。另外，取小鼠肝臟和心臟，用冷生理鹽水沖洗后用濾紙吸干其表面水分，分別制成10%肝勻漿和10%心勻漿，在4℃條件下按4000r/min離心10min后，取其上清液分別測定小鼠肝脂酶(HL)、肝長鏈羥脂酰輔酶A脫氫酶(HACD)和心脂蛋白脂酶(LPL)、心細(xì)胞色素氧化酶(CCO)活性。

TC、TG、HDL-C以及LDL-C均采用全自動生化分析儀進(jìn)行測定。LDL-C含量計(jì)算按公式LDL-C(mmol/L)=TC-(HDL-C+TG/2.2)。LCAT活性測定按照比色法定量檢測試劑盒方法測定[11,12]，CS、CCO活性采用ELISA法按照測定試劑盒要求進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度[13]。HACD按照測定試劑盒要求用比色法進(jìn)行測定。

HL和LPL活性測定根據(jù)試劑盒說明測定生成的FFA含量并分別計(jì)算出HL、LPL活性(單位:μgFFA/mL上清液/h)[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 肥胖小鼠造模的結(jié)果

經(jīng)過8周對小鼠進(jìn)行高血脂造模，結(jié)果見表1。

表1 8周造模后小鼠血脂水平的變化

注：與對照組NC相比*P<0.05，**P<0.01。

分析表1可知，HC組與NC組相比，其TC與TG含量均顯著升高，P<0.05；LDL-C含量更是極顯著性升高，P<0.01，而HDL-C含量有顯著性下降，P<0.05，HDL-C/TC也有顯著性下降，P<0.05，說明高血脂模型組造模成功。

2.1 有氧耐力運(yùn)動對小鼠血脂水平的影響

表2 有氧耐力運(yùn)動對小鼠血脂水平的影響

注：與HC相比*P<0.05，**P<0.01；與NC組相比&P<0.05,&&P<0.01；HE2與HE1組相比#P<0.05。

由表2可知，HC組與NC組相比，其TC與TG含量更是顯著升高，P<0.05；LDL-C含量極顯著性升高，P<0.01，HDL-C含量更具有顯著性下降，P<0.05，HDL-C/TC也有顯著性下降，P<0.05，進(jìn)一步說明高血脂模型組造模成功。HES組、HEM組和HEL組的TC、TG含量與HC組相比均顯著降低(P<0.01或P<0.05)，且HEL1組、HEL2組與NC組相比無顯著性差異；HES組、HEM組和HEL組的HDL-C含量與HC組相比具有顯著性升高(P<0.01或P<0.05)，且HDL-C/TC比值與HC組相比亦均顯著升高(P<0.05)；而LDL-C的含量則隨著有氧耐力運(yùn)動時間的增加而降低(P<0.05)，HEL組與NC組相比不具有顯著性差異(P>0.05)。HES2、HEM2組與HES1、HEM1組的TC、TG以及LDL-C含量相比，均有顯著性降低，P<0.05；而HEL2組與HEL1組各指標(biāo)相比均無顯著性差異，說明在某種程度上，一定時間的耐力運(yùn)動可能對降血脂的作用比飲食控制更為重要。

2.2 有氧耐力運(yùn)動對小鼠血清LCAT以及CS活力的影響

表3 有氧耐力運(yùn)動對小鼠重要代謝酶活力的影響

注：與HC相比*P<0.05，**P<0.01；與NC組相比&P<0.05。

分析表3可知，NC組小鼠血清LCAT以及CS活力與HC組相比均無顯著性差異。而HES組、HEM組和HEL組LCAT活力與HC組相比均顯著升高(P<0.05)；且與NC組相比亦顯著升高(P<0.05)，存在運(yùn)動時間長度與酶活性的正相關(guān)。CS活力在HEM組和HEL組也均顯著高于NC以及HC組(P<0.05)，HEs組活性雖較NC組和HC組高，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

同樣由表3可知，除NC組心LPL活力HC組相比具有顯著差異，即NC組高于HC組(P<0.05)，其余三種酶活力兩組間并無顯著性差異，HES組、HEM組和HEL組與HC、NC組相比各酶活力均顯著升高(P<0.05)，隨著運(yùn)動時間加長各酶活性升高越明顯，運(yùn)動時間與酶活力升高幅度呈正相關(guān)。

但同樣的運(yùn)動時間長度，高脂飼料組HE1與基礎(chǔ)飼料組HE2相比，幾乎所有酶活性顯示出HE1各組高于HE2各組，但沒有顯著性差異。

3 討 論

高脂血癥是導(dǎo)致動脈粥樣硬化和冠心病的主要危險因素。研究發(fā)現(xiàn)，血脂降低可減緩粥樣硬化斑塊的形成進(jìn)程，在一定程度上還可使其逐漸消退,降低冠心病的病死率[2-4]。研究表明，在高脂血癥的相關(guān)指標(biāo)中，TC及LDL-C水平與心血管疾病發(fā)病率之間呈密切正相關(guān)，而HDL-C升高可降低心血管病的發(fā)病率[14,15]。有氧運(yùn)動可顯著改善肥胖人群的高脂血癥，有研究表明一組肥胖人群經(jīng)過4周的有氧耐力訓(xùn)練，體重明顯下降、體脂百分比和血脂顯著降低[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在本實(shí)驗(yàn)的不同運(yùn)動時間下，有氧耐力運(yùn)動降脂效果與其運(yùn)動時間密切相關(guān)，即運(yùn)動時間越長降脂效果越佳。當(dāng)然，運(yùn)動結(jié)合低脂飲食其升高的血脂降低越明顯。

從代謝角度全面闡釋運(yùn)動降血脂的機(jī)理目前的報道還不多。本研究表明運(yùn)動可以加快脂肪的降解、糖的有氧代謝、能量轉(zhuǎn)化和利用，促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)化以及脂蛋白的轉(zhuǎn)化與代謝。脂肪酸降解的主要途徑是β-氧化，羥脂酰輔酶A脫氫酶(HACD)是β-氧化中四個重要的分解酶之一，研究發(fā)現(xiàn)隨著有氧耐力運(yùn)動強(qiáng)度的增加，HACD的活性越高，表明運(yùn)動可促使HACD基因表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)脂肪酸的降解，這不僅與Aoi報道的有規(guī)律的鍛煉通過上調(diào)脂肪分解關(guān)鍵酶基因如肉堿-脂酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、脂酰輔酶A脫氫酶(β-氧化中的另一個脫氫酶)等在肝臟中的表達(dá)結(jié)果一致[8]，也證明了運(yùn)動量與脫氫酶活性的相關(guān)性。

無論是糖有氧氧化還是脂肪酸β-氧化生成的乙酰輔酶A在機(jī)體內(nèi)有幾條出路，如分解產(chǎn)生能量或合成脂肪或膽固醇等。當(dāng)機(jī)體需要能量時，乙酰輔酶A會通過三羧酸循環(huán)進(jìn)行氧化，而檸檬酸合酶(CS)則是乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)的第一個關(guān)鍵酶，該酶控制著三羧酸循環(huán)的入口，決定了糖、脂肪等的氧化速度，本研究首次表明有氧耐力運(yùn)動可增加CS的活力，促進(jìn)糖和脂肪的氧化利用，并且運(yùn)動時間長度與該酶活力成正相關(guān)。

盡管三羧酸循環(huán)是糖、脂肪、甚至是蛋白質(zhì)徹底氧化分解的共同途徑，但真正能量的產(chǎn)生則需要通過線粒體的呼吸鏈將物質(zhì)代謝脫下的氫傳遞給氧，在此過程中產(chǎn)生能量(ATP)。已有研究提示耐力運(yùn)動可使大腦的細(xì)胞色素氧化酶(CCO)活性增強(qiáng)[9]，本研究測定了肝線粒體CCO活性在高脂飲食對照組(HC)最低，而有氧耐力運(yùn)動該酶活性顯著增高，并且具有運(yùn)動時間和酶活性的正相關(guān)。CCO是線粒體中2條呼吸鏈的共有末端組分，催化電子從細(xì)胞色素C到氧原子的傳遞，是線粒體氧化磷酸化的限速酶，在整個能量代謝中發(fā)揮著重要的作用，CCO活性升高，氧氣的利用增多，物質(zhì)代謝速度加快，能量產(chǎn)生增加。

由此，不難發(fā)現(xiàn)，有氧耐力運(yùn)動促使了脂肪酸β-氧化—三羧酸循環(huán)—氧化磷酸化整個連續(xù)過程，促進(jìn)了物質(zhì)的氧化分解和能量的利用，從而減少了脂肪和膽固醇的生成，是降低膽固醇的有效措施。

LCAT是血漿膽固醇酯化、HDL成熟和膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程的關(guān)鍵酶，對于動脈粥樣硬化形成具有重要的保護(hù)作用[18]。LCAT作用于HDL分子表面的卵磷脂,使其Sn-2脂?；D(zhuǎn)移至膽固醇生成膽固醇酯(CE),通過膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用，與極低密度脂蛋白(VLDL)及低密度脂蛋白(LDL)的TG進(jìn)行交換，為肝臟攝取與代謝[19]。有研究顯示遺傳性LCAT缺乏雜合子個體動脈粥樣硬化明顯增加[20]。而有關(guān)運(yùn)動影響肥胖小鼠LCAT的研究較少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，運(yùn)動可使LCAT活力增加，且增加幅度與有氧耐力運(yùn)動有關(guān)，這提示運(yùn)動過程中脂類代謝相關(guān)酶系統(tǒng)做出相應(yīng)改變，脂蛋白轉(zhuǎn)換增強(qiáng)。LPL是調(diào)節(jié)脂蛋白代謝的另一種關(guān)鍵酶,由心、脂肪、骨骼肌細(xì)胞等合成后分泌入血與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的糖萼結(jié)合，作用于血循環(huán)中的乳糜微粒(CM)及VLDL內(nèi)核的TG，使之水解，釋出游離脂肪酸(FFA)[21]。有關(guān)運(yùn)動影響肥胖小鼠LPL的研究較少，但運(yùn)動會提高LPL活力這幾乎是共識的[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，有氧耐力運(yùn)動各組小鼠心LPL活力均升高，提示有氧耐力運(yùn)動小鼠脂蛋白代謝與轉(zhuǎn)化速率加快，釋放出的FFA氧化分解以提供組織細(xì)胞需要的能量。

HL由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到肝竇狀隙內(nèi)皮細(xì)胞表面發(fā)揮作用[23]。HL是參與脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶，是脂肪酶家族成員。HL能識別并結(jié)合血漿中的HDL2及HDL3,水解HDL2中的TG及磷脂，使HDL2轉(zhuǎn)變?yōu)镠DL3，通過該過程實(shí)現(xiàn)肝外組織TC向肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)[24]。肝組織HL能促進(jìn)肝細(xì)胞攝取TC和CM殘粒，降低血漿TG及TC，且HL還具有促進(jìn)餐后血脂清除的作用。因此，HL的合成、分布、活性變化與高脂血癥、脂肪肝、動脈粥樣硬化等密切相關(guān)，HL活性的降低,可引起高脂血癥,并在脂肪肝發(fā)病中起重要作用[18]。有關(guān)運(yùn)動影響高血脂小鼠HL的研究文章尚未見報道。有氧耐力運(yùn)動各組小鼠均表現(xiàn)出HL活性的升高，進(jìn)一步說明有氧耐力運(yùn)動可能會加快脂蛋白的代謝轉(zhuǎn)化，促進(jìn)脂肪酸氧化分解，降低血中脂肪酸含量。

但是研究表明同樣的運(yùn)動對于高脂飼料組各酶活性比基礎(chǔ)飼料組更高，這可能與機(jī)體的調(diào)節(jié)功能密切相關(guān)，即當(dāng)血脂高時，在運(yùn)動的基礎(chǔ)上，相關(guān)的酶表達(dá)增強(qiáng)促使脂類的氧化分解。

總之，本研究較好地揭示了有氧耐力運(yùn)動可顯著改善小鼠的高脂血癥，降血脂作用與運(yùn)動時間長短關(guān)系密切，而運(yùn)動時間長度又與糖、脂肪、能量代謝重要酶活性密切正相關(guān)，運(yùn)動增強(qiáng)糖與脂肪氧化分解和能量消耗、增加脂蛋白轉(zhuǎn)化以及膽固醇逆向運(yùn)輸，減少肝臟脂肪和膽固醇合成，降低血脂水平。