卞貝貝， 李 影， 俞 茜， 彭珊珊

(安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,安徽省重要生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 蕪湖 241000)

引 言

抗生素因具有促進(jìn)生長(zhǎng)和治療疾病的雙重功效而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)。近年來(lái)，在規(guī)?；菪箴B(yǎng)殖的飼料中常常添加了抗生素，尤其對(duì)經(jīng)濟(jì)利益的過(guò)分追求和對(duì)抗生素的盲目依賴，使得抗生素的使用量不斷提高甚至以不合理的高劑量和高頻率使用[1-3]。這些飼料添加劑在提高養(yǎng)殖效率和效益的同時(shí)，也可直接隨糞便或者排泄物排出，并通過(guò)污灌、糞肥施加等途徑而最終導(dǎo)致土壤抗生素污染日益嚴(yán)重[4,5]。

研究表明，強(qiáng)力霉素、土霉素和金霉素等四環(huán)素類抗生素，因?yàn)榫哂袃r(jià)廉質(zhì)優(yōu)、廣譜抗菌等特點(diǎn)，在畜禽生產(chǎn)和漁業(yè)生產(chǎn)中被大量應(yīng)用[5,6]。長(zhǎng)期施用糞肥的農(nóng)田土壤中四環(huán)素類抗生素殘留十分普遍，在土壤中的積累濃度較高[5]。其中強(qiáng)力霉素(Doxycycline，Doxy，又名多西環(huán)素)，是半合成的四環(huán)素類抗菌藥，廣泛用于治療魚類由弧菌、嗜水氣單胞菌、愛德華氏菌等菌種引起的細(xì)菌性疾病。在水體和底泥中常有大量的殘留，造成了水體嚴(yán)重的污染[7]。

蔬菜是我國(guó)居民的重要食品。當(dāng)前，我國(guó)蔬菜種植的主要方式還是土培，并經(jīng)常施用禽畜糞便、魚塘污泥等“有機(jī)肥”，污灌現(xiàn)象比較普遍，這就使得蔬菜受到抗生素影響的概率較大。目前大量研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素類抗生素對(duì)植物生長(zhǎng)具有顯著的毒性效應(yīng)[8,9]，抗生素對(duì)植物的毒理效應(yīng)及潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，與抗生素的結(jié)構(gòu)、植物種類和生長(zhǎng)環(huán)境等眾多因素有關(guān)，而有關(guān)強(qiáng)力霉素對(duì)植物生長(zhǎng)生理的毒性研究相對(duì)較少，開展此類研究十分必要。基于此，本研究以在我國(guó)華東地區(qū)常見的蔬菜上海青(BrassicachinensisL.)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究不同濃度的強(qiáng)力霉素對(duì)上海青生長(zhǎng)及生理代謝的影響，為科學(xué)安全種植蔬菜提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤、植物及試劑

園田土壤和營(yíng)養(yǎng)土以3:1(m/m)混合，該混合土壤作為實(shí)驗(yàn)栽培用土。其中園田土壤采自于安徽師范大學(xué)赭山校區(qū)后山未受抗生素污染的土壤，營(yíng)養(yǎng)土購(gòu)買于江蘇省南京市標(biāo)優(yōu)美生態(tài)工程股份有限公司。供試土壤的基本理化性質(zhì)分別為：有機(jī)質(zhì)含量為2.5g·kg-1；堿解氮含量為0.63g·kg-1；pH含量為7.24。

上海青種子(華禾)購(gòu)于安徽省華禾種業(yè)有限公司，強(qiáng)力霉素(Doxycycline，Doxy)原藥(分析純,大于98%)購(gòu)于安徽省天根生化科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)組處理

處理組一次性添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的強(qiáng)力霉素溶液，以不添加強(qiáng)力霉素的實(shí)驗(yàn)組作為對(duì)照。強(qiáng)力霉素濃度分別為0、5、10、20mg·kg-1，分別標(biāo)記為0、D5、D10、D20。各處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)，穩(wěn)定一周后，每盆播種相同數(shù)量的上海青種子(100粒)，栽培期間保持土壤含水量達(dá)田間最大持水量的60%-70%，溫室培養(yǎng)2個(gè)月，取地上部分葉片待測(cè)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 植物生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 從每盆上海青中隨機(jī)采10株樣品，用自來(lái)水沖洗干凈后，再用蒸餾水反復(fù)漂洗，濾紙擦干，用直尺測(cè)量地上部的長(zhǎng)度為株高，地下部長(zhǎng)度(從根尾到根莖結(jié)合處)為根長(zhǎng)。于分析天平上測(cè)量單株鮮重后，用實(shí)驗(yàn)剪刀剪去根部，再于分析天平中測(cè)量單株地上鮮重和單株地下鮮重。

1.3.2 植物體內(nèi)生理指標(biāo)的測(cè)定 葉綠素含量的測(cè)定參照張志良和瞿偉菁的方法[11]；超氧化物岐化酶活性(SOD)測(cè)定參照張以順等的方法[12]，活性單位用抑制氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原50%時(shí)所需酶量表示；過(guò)氧化氫酶活性(CAT)測(cè)定采用Proinoke的方法[13]，活性單位用在20℃下1分鐘內(nèi)1g植物材料分解過(guò)氧化氫的微克分子數(shù)表示；過(guò)氧化物酶活性(POD)測(cè)定時(shí)的活性單位用20℃下1g分析材料所含酶在1分鐘內(nèi)氧化愈創(chuàng)木酚的微克表示，具體方法也參照Proinoke[13]；丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[11]。

1.4 數(shù)據(jù)的處理與分析

采用單因素方差分析和多重比較法(LSD)分別分析強(qiáng)力霉素污染下上海青的生長(zhǎng)、代謝等在不同濃度組間的差異性。統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS16.0軟件完成，數(shù)據(jù)處理和圖表制作使用Excel2010軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 強(qiáng)力霉素對(duì)上海青生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

不同濃度的強(qiáng)力霉素污染時(shí)，上海青的株高、根長(zhǎng)及單株鮮重在不同的濃度組間存在著顯著的差異(P<0.05)，添加強(qiáng)力霉素組的株高、根長(zhǎng)和單株鮮重均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表1)。盡管其株高和根長(zhǎng)隨強(qiáng)力霉素濃度增加呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，但在組間的差別不具有顯著性。上海青的單株鮮重和單株地上鮮重都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(表1)。當(dāng)強(qiáng)力霉素濃度為20mg·kg-1時(shí)，根長(zhǎng)、單株鮮重、單株地下鮮重及單株地上鮮重分別為對(duì)照組(0)的2.76倍、2.17倍、1.21倍和2.5倍。

表1 強(qiáng)力霉素污染下上海青生長(zhǎng)指標(biāo)的變化

注:不同字母表示同一處理組不同濃度間存在顯著性差異；*：0.05

2.2 強(qiáng)力霉素對(duì)上海青光合色素含量的影響

圖1 強(qiáng)力霉素處理下上海青光合色素含量的變化Fig.1 The changes of content of photosynthetic pigment of B.chinensis L.treated by Doxycycline

不同濃度強(qiáng)力霉素污染下，上海青葉片葉綠素a的含量隨污染濃度的增加而呈持續(xù)下降趨勢(shì)，回歸分析表明，葉綠素a含量與強(qiáng)力霉素濃度之間呈顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.898，p<0.05)，20mg·kg-1強(qiáng)力霉素污染下的葉綠素a含量顯著低于其他濃度組(圖1)。而其葉綠素b和類胡蘿卜素的含量也表現(xiàn)出了一致的趨勢(shì)，即隨抗生素濃度的增加均表現(xiàn)出先下降后上升，10mg·kg-1濃度下的含量均最低(圖1)。

2.3 強(qiáng)力霉素對(duì)上海青MDA含量和抗氧化酶活性的影響

不同濃度強(qiáng)力霉素污染時(shí)，僅CAT酶活性在不同的抗生素處理組間具有顯著差異(P<0.05)(表2)，其活性表現(xiàn)出隨抗生素濃度升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在10mg·kg-1的濃度組時(shí)達(dá)到最高(表2)。MDA、POD和SOD的活性在各處理組間均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表2)。但是，MDA和POD的活性均表現(xiàn)出隨抗生素濃度升高而增加的趨勢(shì)，而SOD變現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。說(shuō)明在該濃度強(qiáng)力霉素的處理下，雖然尚未造成上海青明顯的生理毒害但是體現(xiàn)出了顯著的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，理應(yīng)引起人們的關(guān)注。

3 討 論

已有研究表明，抗生素對(duì)植物根的生長(zhǎng)、單株鮮重等生長(zhǎng)指標(biāo)具有一定的抑制作用，這種作用與抗生素的類型以及植物的種類有關(guān)[9,10,14]。研究表明，土霉素(四環(huán)素類抗生素)對(duì)青菜的株高、鮮重和根重均具有促進(jìn)作用，但對(duì)其根長(zhǎng)有一定的抑制作用[15-17]，本研究中，不同濃度強(qiáng)力霉素處理均對(duì)上海青的根長(zhǎng)、株高、單株鮮重和單株地上鮮重均表現(xiàn)出了一定的促進(jìn)作用?？梢钥闯觯瑥?qiáng)力霉素這種四環(huán)素類抗生素對(duì)上海青的毒性相對(duì)較小。

表2 強(qiáng)力霉素污染下上海青MDA,CAT,POD和SOD酶活性的變化

當(dāng)植物受到外界污染物質(zhì)脅迫時(shí)，其光合色素的含量通常也會(huì)受到影響。本研究中，相比類胡蘿卜素和葉綠素b，強(qiáng)力霉素污染對(duì)葉綠素a含量的影響最為明顯，且表現(xiàn)出了抑制作用?？赡芘c抗生素抑制了原葉綠素酯還原酶等合成葉綠素的酶活性有關(guān)[17]。由于抗生素分子中含有多個(gè)官能團(tuán)易與土壤中不同的金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)生成絡(luò)合物[18-20]，降低了土壤中微量營(yíng)養(yǎng)元素(Cu2+、Fe3+、Mn2+等)的有效性，從而導(dǎo)致植物微量元素缺乏，造成葉綠素合成以及光合代謝的障礙。

本研究表明，強(qiáng)力霉素對(duì)上海青根長(zhǎng)、株高、鮮重以及幼苗體內(nèi)的葉綠素、可溶性蛋白含量和抗氧化酶活性等生理生化指標(biāo)均具有不同程度的影響，說(shuō)明強(qiáng)力霉素污染可以在植物幼苗期就出現(xiàn)毒性效應(yīng)。雖然在低濃度暴露下，對(duì)幼苗的根長(zhǎng)、株高等表型指標(biāo)具有一定的促進(jìn)作用，但實(shí)際上其體內(nèi)的一些生理指標(biāo)已經(jīng)出現(xiàn)了不良的變化。因此，僅以單一的某種生理生化指標(biāo)變化來(lái)判斷其對(duì)植物的毒性效應(yīng)是不夠的，應(yīng)該從不同水平上將幾種生物標(biāo)志物有機(jī)地結(jié)合起來(lái)綜合考慮以更好地反映其對(duì)動(dòng)植物的潛在生態(tài)危害。盡管如此，如果我們長(zhǎng)期將養(yǎng)殖場(chǎng)的糞便用于蔬菜的施肥，從食品安全上看，還是存在一定的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。