張淑芝， 李學(xué)紅， 劉春香

(濰坊學(xué)院 生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點實驗室，山東 濰坊 261061)

0 引 言

實驗教學(xué)是高校課程體系的重要組成部分，對提高學(xué)生的動手操作能力和實踐創(chuàng)新能力有著不可或缺的作用。在傳統(tǒng)的生物學(xué)實驗教學(xué)過程中，驗證性實驗較多，而綜合設(shè)計性實驗較少；各實驗獨立單一，聯(lián)系性不強[1-2]。為了培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力和科研素質(zhì)，提高實驗教學(xué)效果，在保留原有的生物學(xué)實驗課程的基礎(chǔ)上，增設(shè)了生物學(xué)開放性實驗[3-5]。

近年來，隨著各模式生物基因組測序的相繼完成，蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展成為生命科學(xué)領(lǐng)域新的研究熱點。蛋白質(zhì)是基因功能的最終執(zhí)行者，研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能對于探究生命奧秘，指導(dǎo)醫(yī)藥衛(wèi)生具有重要意義[6]。獲得大量高純度有活性的蛋白質(zhì)是進行蛋白質(zhì)研究的基本條件。GST融合蛋白表達系統(tǒng)作為一種常見的原核蛋白表達系統(tǒng)[7]，本身具有細胞增殖速度快、蛋白表達量高、穩(wěn)定性好、表達產(chǎn)物易于純化等優(yōu)點，而被廣泛應(yīng)用于各實驗研究[8-11]。

水通道蛋白(Aquaporin，AQP)是一類廣泛分布于細胞膜上的高效水分子轉(zhuǎn)運孔道，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的水通道蛋白家族成員有13個(AQP0～AQP12)[12-13]。AQP7歸屬水通道蛋白的第2個亞家族，是一種存在于細胞膜上的水和甘油雙轉(zhuǎn)運孔道，因在脂肪代謝、動脈粥樣硬化等生理條件下發(fā)揮重要作用，而成為近年來的研究熱點[14-17]。本文選用與教師科研課題相結(jié)合的題目，基于GST融合蛋白表達系統(tǒng)構(gòu)建原核表達載體pGEX-4T-1∕AQP7，IPTG誘導(dǎo)表達GST-AQP7融合蛋白，并對表達產(chǎn)物進行純化。

1 材料與方法

1.1 材 料

pGEX-4T-1表達載體、E.coliDH5α菌株、E.coliBL21菌株為本實驗室保存。pMD18-T載體、連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為TAKARA 公司產(chǎn)品；PCR相關(guān)產(chǎn)品、IPTG、蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；Glutathione Sepharose 4B為Pharmacia公司產(chǎn)品。

1.2 擴增AQP7-C末端親水性肽段區(qū)基因片段

參照Genebank數(shù)據(jù)庫，借助核苷酸序列分析軟件DNA Strider對小鼠AQP7基因全序列進行親水性分析。引物選?。荷嫌?′-GAATTCCCACAGGATCCTC-AGAG-3′，下游5′-CTCGAGCACAGAGCCACTTATG-3′。以實驗室現(xiàn)有質(zhì)粒pcDNA3.1/AQP7為模板，PCR擴增AQP7-C末端，自796～894位共99bp的親水性肽段區(qū)基因片段。擴增參數(shù)：95 ℃ 1 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3 構(gòu)建重組載體pMD18-T/AQP7和pGEX-4T-1/AQP7

pMD18-T和PCR擴增產(chǎn)物混合，室溫條件下T4連接酶連接1 h。將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細胞DH5α按1∶10的體積比進行轉(zhuǎn)化，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆，繼續(xù)培養(yǎng)后，進行重組質(zhì)粒提取。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對pMD18-T/AQP7重組質(zhì)粒酶切鑒定，選取陽性質(zhì)粒，回收對應(yīng)的AQP7-C末端親水性肽段區(qū)基因片段?；厥掌闻c雙酶切后的pGEX-4T-1表達載體16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒提取，并對重組表達載體pGEX-4T-1/AQP7進行PCR鑒定和DNA測序分析。

1.4 表達純化GST-AQP7融合蛋白

取10 μL pGEX-4T-1/AQP7重組表達載體轉(zhuǎn)化入100 μLE.coliBL21感受態(tài)細胞，接種LB/Amp+固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落克隆接種于LB/Amp+液體培養(yǎng)基，先進行2 mL小量培養(yǎng)，當(dāng)細菌生長達到對數(shù)生長期，即菌液OD600值為0.5時，加入不同濃度的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達，IPTG濃度依次設(shè)置為0、0.1、0.2、0.5 mmol/L。SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達情況，優(yōu)化表達條件，確定有效誘導(dǎo)GST-AQP7融合蛋白表達的IPTG濃度。將轉(zhuǎn)化pGEX-4T-1/AQP7質(zhì)粒的菌液擴大培養(yǎng)，大量誘導(dǎo)表達GST-AQP7融合蛋白，超聲裂解細菌，離心，取上清，用Glutathione Sepharose 4B親和層析法收集上清液中的融合蛋白，經(jīng)洗脫液洗脫，得高純度的GST-AQP7融合蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 AQP7-C末端肽段親水性分析

用DNA Strider序列軟件對AQP7基因全序列進行親水性分析，結(jié)果如圖1所示，水平線上方為AQP7疏水肽段區(qū);下方為親水肽段區(qū)。為提高融合蛋白的可溶性，以利于后續(xù)對表達蛋白的純化，本研究選取AQP7-C末端，自266～298共33個氨基酸的親水性肽段區(qū)為研究對象。

圖1 AQP7蛋白序列親水性分析

2.2 AQP7-C末端基因片段的PCR擴增

以pcDNA3.1/AQP7質(zhì)粒為模板，PCR擴增AQP7-C末端親水區(qū)基因序列，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在約100bp處出現(xiàn)特異性條帶(見圖2)，與預(yù)期設(shè)計的99bp DNA片段長度相符合。

2.3 重組質(zhì)粒pMD18-T/AQP7的酶切鑒定

重組質(zhì)粒pMD18-T/AQP7經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果呈現(xiàn)一大和一小兩條帶，大片段為pMD18-T載體(2692bp)，小片段為AQP7-C末端親水性肽段區(qū)基因片段(99bp)，如圖3所示。酶切鑒定結(jié)果表明重組質(zhì)粒pMD18-T/AQP7構(gòu)建成功。

圖2 AQP7-C端親水區(qū)基因片段的PCR擴增

M-DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),1～2-AQP7-C末端親水區(qū)基因片段的PCR擴增產(chǎn)物

圖3 重組質(zhì)粒pMD18-T/AQP7的酶切鑒定

M-DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),1，2-重組質(zhì)粒pMD18-T/AQP7的EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定結(jié)果

2.4 重組表達載體pGEX-4T-1/AQP7的鑒定

選取鑒定正確的pMD18-T/AQP7重組質(zhì)粒，酶切回收AQP7-C末端親水性肽段區(qū)基因片段，連接到pGEX-4T-1原核表達載體，構(gòu)建重組表達載體pGEX-4T-1/AQP7。將構(gòu)建好的pGEX-4T-1/AQP7進行PCR鑒定，電泳結(jié)果呈現(xiàn)約99bp的特異條帶(見圖4)，證明重組表達載體構(gòu)建正確。用表達載體pGEX-4T-1特異性的引物進行DNA測序，結(jié)果如圖5所示，進一步證實了目的基因的正確性。

圖5 重組表達載體pGEX-4T-1/AQP7的測序結(jié)果

2.5 GST-AQP7融合蛋白的誘導(dǎo)表達及純化

將轉(zhuǎn)化重組表達載體pGEX-4T-1/AQP7的對數(shù)生長期菌液用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)，優(yōu)化表達條件。發(fā)現(xiàn),當(dāng)IPTG濃度為0.1 mmol/L時，融合蛋白表達效率最高，故選取該濃度大量誘導(dǎo)表達GST-AQP7融合蛋白。收集菌體，超聲裂解破碎細胞，離心，取上清液，用Glutathione Sepharose 4B親和層析純化融合蛋白，SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍染色，結(jié)果如圖6(a)所示。表明Glutathione Sepharose 4B親和層析法可有效純化GST-AQP7融合蛋白，經(jīng)純化后的上清液中幾乎沒有融合蛋白殘留。擴增的AQP7-C末端親水區(qū)基因片段大小為99bp，對應(yīng)的蛋白相對分子質(zhì)量約4kD，因為GST標(biāo)簽本身相對分子質(zhì)量約為26kD，計算GST-AQP7融合蛋白的相對分子質(zhì)量約為30kD，SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果驗證了表達的GST-AQP7融合蛋白大小的正確性(見圖6(b))。上述實驗結(jié)果表明，融合蛋白在E.coli BL21原核細胞中高效表達且被有效純化。

(a) Glutathione Sepharose 4B親和層析法對GST-AQP7融合蛋白的純化效率鑒定

M-蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn),1-GST標(biāo)簽蛋白對照,2-純化的GST-AQP7融合蛋白,3-Glutathione Sepharose 4B結(jié)合后的上清液

M-蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn),1，4-BSA蛋白對照(66kD),2，5-純化的GST-AQP7融合蛋白(30kD),3，6-GST標(biāo)簽蛋白對照(26kD)

3 結(jié) 語

GST融合蛋白表達系統(tǒng)作為眾多蛋白表達系統(tǒng)中的一種，因表達效率高，純化條件溫和，能很好地保持蛋白固有的結(jié)構(gòu)和功能而被廣泛應(yīng)用于各實驗研究[8-11]。本實驗涉及目的基因的克隆，表達載體的構(gòu)建，目的蛋白的誘導(dǎo)表達與純化，涵蓋了現(xiàn)代分子生物學(xué)的多項關(guān)鍵實驗技術(shù)，可以很好地訓(xùn)練學(xué)生的實驗操作技能。借助實驗，學(xué)生分析問題和解決問題的能力同樣得到了提升，例如在確定IPTG有效誘導(dǎo)濃度的問題上，學(xué)生通過嘗試設(shè)置不同濃度的對比實驗，最終確定本實驗中誘導(dǎo)GST-AQP7高表達的IPTG濃度為0.1 mmol/L；在菌體的超聲裂解問題上，為保證菌體的有效破碎，同時又要兼顧GST-AQP7融合蛋白的完整性，學(xué)生經(jīng)過多次預(yù)實驗，最終將超聲程序設(shè)定為：超聲5 s，間歇5 s，共重復(fù)25次。學(xué)生在順利完成上述實驗的基礎(chǔ)上，對本實驗的后續(xù)研究表現(xiàn)出濃厚的興趣，如：融合蛋白中GST標(biāo)簽的切除，對純化蛋白的進一步鑒定及有效應(yīng)用等。因此，本實驗還有很大的延伸空間，可以指導(dǎo)學(xué)生根據(jù)自身的專業(yè)基礎(chǔ)和學(xué)習(xí)興趣，開展后續(xù)實驗研究，以培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)探究精神。