高鵬辛嘉英張?zhí)m威

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150076；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076；3.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000）

玉米淀粉作為制備可生物降解材料的原料對環(huán)境污染治理和石油危機(jī)都有重要意義。但由于其分子間和分子內(nèi)部多羥基的相互作用，以及其具有一定規(guī)整的結(jié)晶性，玉米原淀粉受熱時(shí)，分解溫度低于熔融溫度，導(dǎo)致其成膜性較差。經(jīng)酯化后的淀粉不僅降低了老化回生、糊凝膠化、脫水縮合現(xiàn)象，也改變了淀粉糊透明度、光澤度、黏度特性、凝膠質(zhì)構(gòu)、成膜性、熱穩(wěn)定性、乳化及乳化穩(wěn)定性，廣泛應(yīng)用在食品、藥品、紡織、造紙等行業(yè)。此外，酯化淀粉在表面包裝材料和可生物降解材料上有潛在的應(yīng)用前景[1-2]。阿魏酸淀粉酯是一種新型的阿魏酸糖基衍生物，具有抗氧化、抗菌、抗炎癥、抗血栓、抗癌、治療冠狀動(dòng)脈疾病，降低膽固醇和增加精子活力等功效[3-4]。而且，阿魏酸淀粉酯具有較強(qiáng)的抗α-淀粉酶水解能力，可以減少其在腸胃中被淀粉酶水解的機(jī)會(huì)，增加進(jìn)入大腸的可能性。阿魏酸淀粉酯進(jìn)入結(jié)腸后，淀粉會(huì)被結(jié)腸中的微生物完全發(fā)酵降解，將阿魏酸釋放出來，更好地發(fā)揮其抗結(jié)腸癌的作用。因此，淀粉可以作為阿魏酸的合適載體，將阿魏酸帶入肝腸循環(huán)并完全釋放，作為阿魏酸的潛在供體[5-7]。阿魏酸淀粉酯的合成解決了阿魏酸，無法進(jìn)入結(jié)腸發(fā)揮作用的難題。目前，對于阿魏酸淀粉酯的合成研究很少，藍(lán)志東等于2001年報(bào)道采用化學(xué)法合成了阿魏酸淀粉酯[8]，本課題組初步研究了在非水相體系中用脂肪酶作為催化劑催化阿魏酸淀粉酯的合成[9]。用生物法合成阿魏酸淀粉酯相對于化學(xué)法來說更安全，適合應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥以及精細(xì)石油化工等行業(yè)，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍，強(qiáng)化了淀粉酯化改造阿魏酸的現(xiàn)實(shí)意義。但利用脂肪酶催化合成阿魏酸淀粉酯存在一個(gè)瓶頸問題，由于阿魏酸和淀粉均不是脂肪酶的天然底物，導(dǎo)致酶促反應(yīng)不易發(fā)生，產(chǎn)物取代度低，脂肪酶的催化反應(yīng)活性受到抑制。曾擬采用微波輔助法解決此問題，但由于微波作用時(shí)間過長會(huì)使脂肪酶失活，效果并不明顯。

納米金由于具有很好的生物親和性和良好的納米材料特性，其作為生物催化劑備受青睞。一些研究已經(jīng)證明，納米金可以作為生物催化劑催化酯化反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)[10]。在反膠束體系內(nèi)，納米金粒徑及用量是影響其催化活性的主要因素[11]。為了解決脂肪酶催化阿魏酸淀粉酯合成的瓶頸問題，本研究擬向反應(yīng)體系中加入納米金，欲借助納米金的熱點(diǎn)效應(yīng)及微波傳導(dǎo)效應(yīng)提高酶促反應(yīng)活性。此研究也為功能性改性淀粉的生物制備提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

預(yù)處理玉米淀粉：黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制；阿魏酸乙酯（＞97%）、氯金酸（＞99.9%）：上海同田生物科技有限公司；Novozyme 435固定化南極假絲酵母脂肪酶（10 000 U/g）：丹麥諾維信公司；檸檬酸鈉及其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

UV2550型紫外-可見分光光度計(jì)：日本島津公司；XH-100A微波反應(yīng)器：北京祥鵠科技發(fā)展公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 納米金的制備

取100 mL 0.01%氯金酸溶液置于平底燒瓶中，加熱至沸騰，在氯金酸溶液保持沸騰的狀態(tài)下加入1%檸檬酸鈉溶液2 mL，持續(xù)加熱，當(dāng)溶液顏色變?yōu)榫萍t色時(shí)停止加熱。冷卻，4℃低溫保存。

1.2.2 脂肪酶催化阿魏酸淀粉酯的合成

1）常規(guī)加熱法：所有試劑使用之前進(jìn)行分子篩脫水預(yù)平衡，將一定量阿魏酸乙酯加入到50 mL三角瓶中，加入10 mL異辛烷，底物溶解后加入一定量預(yù)處理淀粉（淀粉與阿魏酸乙酯的摩爾比為1∶3）在磁力攪拌的作用下混溶，加入一定量納米金和淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Novozym435脂肪酶磁力攪拌作用下混勻后在油浴中開始反應(yīng)，反應(yīng)溫度65℃，反應(yīng)時(shí)間為18 h。反應(yīng)完成后，用無水乙醇洗滌產(chǎn)物直至濾液中無剩余阿魏酸乙酯，洗滌后產(chǎn)物放于70℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥，研磨、過篩并保存。

2）微波輔助法：反應(yīng)體系與常規(guī)加熱法一致，當(dāng)體系構(gòu)建好之后將反應(yīng)體系在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下充分?jǐn)嚢? min，使得各組分混合均勻再置于微波反應(yīng)器中進(jìn)行反應(yīng)，XH-100A微波反應(yīng)器可以實(shí)現(xiàn)恒溫條件下，微波功率的持續(xù)輸出。

1.2.3 產(chǎn)物取代度的測定

采用UV2550型紫外-可見分光光度計(jì)對產(chǎn)物取代度進(jìn)行測定，將產(chǎn)物的堿水解液用氯仿萃取，測得水解后阿魏酸的吸光值，經(jīng)回歸方程計(jì)算其含量，從而得到取代度[12]。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

準(zhǔn)確稱取一定量的阿魏酸定容于定量體積的氯仿中，配制得到質(zhì)量濃度為 0、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 g/L的阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在320 nm左右波長下測得不同濃度溶液的吸光值，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 阿魏酸淀粉酯水解

稱取0.10 g產(chǎn)物于50 mL三角瓶中，加入30 mL 0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液，50℃下攪拌水解3 h。用0.1 mol/L的鹽酸滴定調(diào)節(jié)pH≈2，靜置一段時(shí)間移取上清水解液20 mL于分液漏斗中，用氯仿萃取收集萃取液定容至100 mL[13]。

1.2.6 取代度（DS）計(jì)算

將產(chǎn)物萃取液置于UV2550紫外-可見分光光度計(jì)在320 nm下測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到產(chǎn)物中阿魏酸含量，并按下式計(jì)算取代度[9]：

式中：W為阿魏酸在阿魏酸淀粉酯中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；C為根據(jù)阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的阿魏酸質(zhì)量濃度，mg/L；V 為萃取液體積，mL；m0為產(chǎn)物質(zhì)量，g；M為阿魏酸相對分子質(zhì)量，194.19。

1.2.7 產(chǎn)物定性分析

1.2.7.1 紫外光譜分析

采用UV2550紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行全波長掃描，掃描條件：雙光束，掃描范圍800 nm～200 nm，狹縫寬度1.0 nm。

1.2.7.2 核磁共振氫譜分析

將樣品溶于二甲基亞砜進(jìn)行核磁共振氫譜測試。觀察頻率：400 MHz，譜寬（δ）：0～15，探頭：5 mm，脈沖序列：30，測定溫度：25℃。

1.2.8 納米金的透射電鏡分析

反應(yīng)體系中的納米金在進(jìn)行透射電鏡分析前，需將反應(yīng)體系混合物用乙醇沉出烘干制成粉末，該粉末用蒸餾水在超聲波輔助條件下復(fù)溶10 min后送檢，進(jìn)行常規(guī)透射電鏡檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米金對酶促反應(yīng)的影響

納米金對酶促反應(yīng)的影響，與加熱方式有關(guān)。圖1為常規(guī)加熱與微波輻射加熱條件下，不同催化劑催化阿魏酸淀粉酯合成的結(jié)果圖。

圖1 常規(guī)加熱和微波輻射條件下納米金對酶促反應(yīng)的影響Fig.1 The effect of AuNPs on the enzymatic reaction under the conventional heating and microwave

如圖1所示，當(dāng)采用常規(guī)加熱法進(jìn)行阿魏酸淀粉酯合成時(shí)，納米金的加入并沒有明顯提高酶促反應(yīng)活性。而在該反應(yīng)體系中，納米金也具有一定的催化反應(yīng)活性，此時(shí)取代度的增加基本為納米金的催化作用與脂肪酶催化作用的疊加。當(dāng)采用微波輔助法進(jìn)行阿魏酸淀粉酯合成時(shí)，若納米金和脂肪酶單獨(dú)使用，納米金的催化反應(yīng)活性明顯提高，而脂肪酶的催化反應(yīng)活性的提高并不顯著；而當(dāng)二者同時(shí)使用時(shí)，取代度的增加會(huì)表現(xiàn)出耦合效應(yīng)。這可能是由于微波輻射具有選擇性吸收的特點(diǎn)[14]，當(dāng)體系中有納米金存在時(shí)，納米金可以完全吸收體系中的微波輻射能，產(chǎn)生的熱點(diǎn)效應(yīng)使其周圍的底物被活化的同時(shí)，避免脂肪酶吸收微波瞬間高熱而失活。

納米金在加入反應(yīng)體系前后的分布狀態(tài)，通過透射電鏡觀察結(jié)果見圖2。

如圖2所示，由于淀粉具有防止納米金團(tuán)聚的作用，因此納米金在反應(yīng)體系中仍然保持均勻分散狀態(tài)，并且粒徑適當(dāng)時(shí)部分納米金會(huì)進(jìn)入到淀粉結(jié)構(gòu)中，此時(shí)納米金作為微波輻射能的載體，借助其產(chǎn)生的熱點(diǎn)效應(yīng)及催化作用使得阿魏酸淀粉酯的取代度大大提高。

圖2 納米金加入反應(yīng)體系前后透射電鏡圖Fig.2 The transmission electron microscopy（TEM）of AuNPs

2.2 納米金粒徑對酶促反應(yīng)的影響

在微波輔助催化阿魏酸淀粉酯合成的反應(yīng)系統(tǒng)中，納米金的加入會(huì)提高阿魏酸淀粉酯的取代度，但納米金的粒徑對其會(huì)產(chǎn)生一定的影響，如圖3所示。

從圖3結(jié)果可以看出，當(dāng)納米金粒徑大約小于150 nm的范圍內(nèi)，納米金粒徑為40 nm時(shí)阿魏酸淀粉酯的取代度最大。之后隨著納米金粒徑的變大，阿魏酸淀粉酯的取代度基本保持不變，當(dāng)納米金粒徑大約在大于500 nm之后又會(huì)有一個(gè)相對明顯的升高。這一現(xiàn)象與納米金的本身特點(diǎn)有關(guān)，若納米金作為催化劑其粒徑越小催化活性越大[14-15]，而對于其產(chǎn)生的熱點(diǎn)效應(yīng)，則是在一定范圍內(nèi)，粒徑越大熱點(diǎn)效應(yīng)越顯著?；诖朔治霰驹囼?yàn)的結(jié)果，說明該反應(yīng)主要受益于納米金在微波輻射下產(chǎn)生的熱點(diǎn)效應(yīng)。

2.3 納米金用量對酶促反應(yīng)的影響

在微波輔助酶促阿魏酸淀粉酯的合成體系中，不僅納米金的粒徑會(huì)對反應(yīng)產(chǎn)生影響，納米金的用量也會(huì)對阿魏酸淀粉酯的合成產(chǎn)生明顯影響，如圖4所示。在研究過程中，納米金是以溶液的形式加入，所以納米金的用量不宜過多。

圖3 納米金粒徑對酶促反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of the size of AuNPs on the enzymatic reaction under microwave

圖4 納米金用量對酶促反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of the amount of AuNPs on the enzymatic reaction under microwave

圖4結(jié)果表明，起初阿魏酸淀粉酯的取代度會(huì)隨著納米金用量的增加而提高，但當(dāng)納米金的加入量超過0.8%后，阿魏酸淀粉酯的取代度開始下降。這主要是由于，納米金加入的同時(shí)會(huì)改變體系的含水量，因?yàn)樵摲磻?yīng)為轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，過多的水會(huì)使反應(yīng)朝著水解的方向進(jìn)行。并且，該研究所用的納米金是通過檸檬酸鈉法合成的，大量Na+的存在，也會(huì)影響酶的活性。但由于該反應(yīng)是非均相體系反應(yīng)，適當(dāng)?shù)乃趾繒?huì)提高固相淀粉顆粒的分散均勻性，降低體系黏度，且避免了反應(yīng)后期因異辛烷揮發(fā)造成底物及產(chǎn)物掛壁不易回收等問題。并且與最大取代度相比，當(dāng)納米金用量為0.8%時(shí)，阿魏酸淀粉酯的取代度僅下降了5.5%并不明顯。綜合考慮，最佳納米金用量為0.8%。

2.4 微波功率對酶促反應(yīng)的影響

納米金輔助微波耦合酶促阿魏酸淀粉酯合成的反應(yīng)中，在低功率微波輻射條件下，阿魏酸淀粉酯的取代度最大。這一結(jié)果與一致認(rèn)為的低功率微波有利于酶促反應(yīng)進(jìn)行是一致的。微波功率對酶促反應(yīng)的影響見圖5。

圖5 微波功率對酶促反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of microwave power on the enzymatic reaction

當(dāng)微波功率為80 W時(shí)，阿魏酸淀粉酯的取代度最大為0.178 9。而當(dāng)微波功率升高至320 W時(shí)，取代度下降至0.012。然而，對于納米金的熱點(diǎn)效應(yīng)來說，通常微波功率越大，納米金產(chǎn)生的熱點(diǎn)效應(yīng)越顯著，但圖4結(jié)果卻與這一理論相悖[14-15]。綜合前面結(jié)果說明，在整個(gè)反應(yīng)過程中微波輻射和脂肪酶產(chǎn)生的耦合效應(yīng)是在納米金的保護(hù)作用下實(shí)現(xiàn)的。因此，在有納米金存在的條件下，微波功率也不宜過高，高功率產(chǎn)生的熱點(diǎn)效應(yīng)較為強(qiáng)烈，同樣會(huì)使脂肪酶失活。故最佳功率為80 W。

2.5 微波時(shí)間對酶促反應(yīng)的影響

納米金的加入可以適當(dāng)延長酶促反應(yīng)時(shí)間，如圖6所示。在納米金的保護(hù)作用下，脂肪酶不會(huì)因?yàn)槲⒉ㄝ椛渥饔枚杆偈Щ睢?/p>

圖6 微波時(shí)間對酶促反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of time on the enzymatic reaction

當(dāng)在反應(yīng)體系中加入納米金，反應(yīng)180 min后，阿魏酸淀粉酯的取代度仍然可以達(dá)到0.14左右，最佳反應(yīng)時(shí)間為120 min，取代度為0.178 9。而不加納米金時(shí)，反應(yīng)到120 min以后基本就不再發(fā)生，最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min，取代度為0.015 6。并且在反應(yīng)前30 min無論是否加入納米金，阿魏酸淀粉酯的取代度隨反應(yīng)時(shí)間的延長，增加程度基本一致。由此進(jìn)一步證明，納米金的加入對脂肪酶具有保護(hù)作用，使其催化活性不易被破壞，從而使得微波輻射與脂肪酶之間的耦合作用得以實(shí)現(xiàn)并持續(xù)進(jìn)行。而微波輻射與脂肪酶之間的耦合效應(yīng)是在反應(yīng)進(jìn)行30 min以后開始發(fā)生。

2.6 阿魏酸淀粉酯的定性分析

用無水乙醇反復(fù)洗滌產(chǎn)物至無阿魏酸乙酯及阿魏酸（避免副反應(yīng)阿魏酸乙酯水解產(chǎn)物，通過薄層層析分析基本無阿魏酸[9]）檢出后，對產(chǎn)物進(jìn)行堿液水解、氯仿萃取，萃取液進(jìn)行紫外吸收光譜全波長掃描分析。分析結(jié)果見圖7。

圖7 產(chǎn)物阿魏酸淀粉酯水解后紫外色譜全波長掃描分析圖Fig.7 UV-vis absorption spectrum of hydrolysate of starch ferulate

由圖7可以看出，在波長315 nm左右出現(xiàn)特征吸收峰，而阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收峰也在315 nm附近，這一結(jié)果初步證實(shí)阿魏酸淀粉酯成功合成。為進(jìn)一步排除阿魏酸乙酯殘留的干擾，充分證實(shí)產(chǎn)物的合成，對純化后的產(chǎn)物進(jìn)行1H NMR譜圖分析，如圖8所示。圖中橫坐標(biāo)為在磁場作用下不同化學(xué)基團(tuán)上氫核共振產(chǎn)生的化學(xué)位移值。通過圖中各共振峰出現(xiàn)的信號(hào)位移值判斷此化合物中有哪些化學(xué)基團(tuán)。

由圖 8（a）、圖 8（b）、圖 8（c）可知 δ3.07～δ3.59 以及δ4.56～δ5.47產(chǎn)生的共振峰為淀粉分子中氫核的共振峰；δ4.15以及δ6.44～δ7.56產(chǎn)生的共振峰為阿魏酸乙酯上氫核的共振峰。而對比阿魏酸乙酯和產(chǎn)物阿魏酸淀粉酯的1H NMR譜圖，阿魏酸乙酯在δ9.60出現(xiàn)的特征共振峰，而產(chǎn)物在此位置并未出現(xiàn)，這一結(jié)果說明產(chǎn)物譜圖中出現(xiàn)的阿魏酸乙酯的相關(guān)振動(dòng)峰并非阿魏酸乙酯殘留所導(dǎo)致，而是阿魏酸側(cè)鏈成功接到淀粉鏈上。這也證明用乙醇反復(fù)洗滌可以徹底去除未反應(yīng)的阿魏酸乙酯。結(jié)合紫外光譜分析，證明了阿魏酸淀粉酯的合成。

圖8 1H NMR分析譜圖Fig.8 1H NMR spectrum

3 結(jié)論

在微波輔助酶促阿魏酸淀粉酯合成反應(yīng)體系中加入適量的納米金可以明顯地提高阿魏酸淀粉酯的取代度。通過紫外光譜結(jié)合1H NMR譜圖分析，證明阿魏酸淀粉酯的合成。當(dāng)納米金粒徑為700 nm，添加量為0.8%，微波功率為80 W，反應(yīng)時(shí)間為120 min的條件下，阿魏酸淀粉酯的取代度最大為0.179 8，較現(xiàn)有研究提高一個(gè)數(shù)量級(jí)。這一結(jié)果，表明在微波耦合脂肪酶催化反應(yīng)體系中加入納米金可以有效提高酶促反應(yīng)活性，增加阿魏酸淀粉酯的取代度。透射電鏡分析結(jié)果顯示部分納米金會(huì)插入到淀粉的分子結(jié)構(gòu)中，并且在淀粉的保護(hù)作用下納米金仍然保持均勻分布狀態(tài)，結(jié)合試驗(yàn)現(xiàn)象可以判定，在該反應(yīng)體系中納米金的促進(jìn)作用，主要是通過其吸收微波后產(chǎn)生的熱點(diǎn)效應(yīng)，以及對脂肪酶的保護(hù)作用來實(shí)現(xiàn)，進(jìn)而使微波輻射與脂肪酶能夠產(chǎn)生耦合效應(yīng)。