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(1.海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228; 2.海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點實驗室,海南海口 570228)

明膠是纖維狀膠原蛋白大分子在一定條件下部分水解的產(chǎn)物[1],因其具有良好的流變性、乳化性、成膜性等優(yōu)良品質(zhì),常作為澄清劑、膠凝劑被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等工業(yè)生產(chǎn)中[2]。近年來，全球?qū)τ诿髂z的需求持續(xù)增長,2011年全球明膠產(chǎn)量已達(dá)34.89萬噸,預(yù)計到2018年將達(dá)45.07萬噸[3]。然而,傳統(tǒng)上的明膠一般是由陸棲動物的皮和骨骼制備而成,由于瘋牛病和口蹄疫的出現(xiàn)以及一些宗教的限制,近些年來對水產(chǎn)源明膠的研究廣受研究者的關(guān)注。

羅非魚,又稱非洲鯽魚,被譽(yù)為未來動物性蛋白主要來源之一,近年來我國羅非魚的出口增值率一直居世界首位[4]。而羅非魚加工業(yè)產(chǎn)生的大量魚皮、魚鱗等下腳料所占比重高達(dá)原材料的20%～30%[5-6],其中魚皮膠原蛋白含量豐富。因此,有效地把魚皮用作明膠的生產(chǎn),不僅可以節(jié)約資源減輕污染,而且可以帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

膠原蛋白受熱變性即可衍生成明膠,膠原蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槊髂z包含兩個過程:一是蛋白的變性,即膠原蛋白受熱分解,螺旋結(jié)構(gòu)解鏈;二是共價交聯(lián)的水解過程,膠原蛋白分子在酸、堿、酶的作用下交聯(lián)鍵部分裂解,膠原蛋白轉(zhuǎn)化為可溶性明膠[7]。而膠原蛋白轉(zhuǎn)化為明膠的程度與許多因素有關(guān),如提取溫度、pH等。溫度是提取明膠過程中一個非常重要的參數(shù),不僅影響得率,對明膠的性質(zhì)也有一定影響[8-9]。目前還沒有關(guān)于提取溫度影響羅非魚皮明膠性質(zhì)方面的相關(guān)研究。因此,本實驗以羅非魚皮為原料,探討提取溫度對明膠的得率、凝凍強(qiáng)度、分子質(zhì)量、熱變性溫度和流變性能等性質(zhì)的影響,旨在有效利用魚皮資源,并為羅非魚皮明膠的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚皮 海南翔泰漁業(yè)股份有限公司(冷凍儲存時間不超過90 d);異丙醇、氯化鈉、鹽酸 廣州化學(xué)試劑廠;十二烷基磺酸鈉、Tris-HCl、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine,TEMED) 碧云天生物科技有限公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品 美國賽默飛世爾科技有限公司;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

JS-Ⅲ凍力測試儀、HW-Ⅲ恒溫水箱、ZL-Ⅲ制冷機(jī) 天津旭陽儀器設(shè)備有限公司;EYEL4 Mpdel冷凍干燥機(jī) 日本TOKYO RIKAKIKAI公司;DSC131EV差示掃描量熱儀 法國塞塔拉姆儀器公司;DYCZ-24DN垂直電泳系統(tǒng) 北京市六一儀器廠;TV-1900雙光束紫外可見光分光光度計 北京普析通用儀器公司;Stratos高速冷凍離心機(jī) 美國賽默飛世爾科技有限公司;DISICOVERY HR-2流變儀 美國TA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羅非魚皮預(yù)處理 羅非魚皮解凍去鱗、去骨,并用刀刮除表面脂肪,剪成1 cm×1 cm的碎片,洗凈瀝干后,4 ℃條件下于體積分?jǐn)?shù)20%異丙醇中萃取24 h脫脂,水洗充分瀝干,置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氯化鈉溶液(1∶20,m/V)中浸泡,并連續(xù)攪拌12 h以去除魚皮中的雜蛋白,2 h換一次液,去離子水漂洗后瀝干。

1.2.2 羅非魚皮明膠的提取 預(yù)處理的羅非魚皮與0.2 mol/L 鹽酸溶液以1∶5的比例混合浸泡30 min,水洗pH至4～5,以1∶10 (m/V)的比例添加去離子水在不同溫度(30、40、50、60、70、80、90 ℃)水浴抽提5 h,10000 r/min離心10 min,紗布過濾后于-50 ℃冷凍干燥48 h得到成品明膠。

1.2.3 羅非魚皮明膠得率的計算 根據(jù)冷凍干燥后的魚皮及魚皮明膠的重量,按照以下公式計算得率。

1.2.4 羅非魚皮明膠的SDS-PAGE分析 參考Hao等[10]采用的直板電泳方法,分析魚皮明膠的分子量分布,稱取一定量明膠樣品,溶解于去離子水中配制5 mg/mL的魚皮明膠溶液。配制5%的分離膠和4%的濃縮膠,采用不連續(xù)的Tris-甘氨酸電泳系統(tǒng),在80 V穩(wěn)流電壓的條件下進(jìn)行分析,電泳時間約1.5 h。電泳結(jié)束后,考馬斯亮藍(lán)染色液染色2 h,脫色后于凝膠成像系統(tǒng)中拍照分析。

1.2.5 羅非魚皮明膠凝凍強(qiáng)度的測定 參考陳小雷[11]的方法,配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.67%的明膠溶液,于(10±0.5) ℃條件下放置成熟16～18 h后,用探頭直徑為12.7 mm的凍力儀進(jìn)行測定,下壓高度為4 mm,下壓速率1 mm/s。選取多個位置進(jìn)行凝凍強(qiáng)度的測定,平行測定3次,計算平均值。

1.2.6 羅非魚皮明膠的紫外吸收光譜掃描 魚皮明膠的紫外吸收光譜掃描參考趙蒼碧等[12]的方法,并適當(dāng)修改。取適量明膠樣品,配制成濃度為1.0 mg/mL的明膠溶液。在190～400 nm波長范圍內(nèi)對明膠溶液進(jìn)行紫外吸收掃描,以去離子水為對照,分辨率為0.5 nm。

1.2.7 羅非魚皮明膠的傅里葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)分析 根據(jù)Muyonga等[13]的方法,取2 mg明膠樣品與適量溴化鉀粉末,在干燥條件下置于瑪瑙研缽中充分研磨后手動壓片,置于樣品室內(nèi)進(jìn)行分析。紅外光譜掃描范圍為4000～500 cm-1,分辨率為2 cm-1。

1.2.8 羅非魚皮明膠熱變性溫度的測定 稱取明膠樣品8～10 mg于鋁鍋中,加蓋密封后置于差示掃描量熱儀的樣品槽中進(jìn)行分析,掃描溫度為30～130 ℃,升溫速率為10 ℃/min。

1.2.9 羅非魚皮明膠的流變學(xué)特性分析 參考Dileep等[14]的方法,采用DHR-2流變儀測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.67%的明膠溶液的彈性模量(G′)和黏性模量(G″)的流變學(xué)曲線,掃描溫度為20 ℃,剪切頻率為0.01～10 Hz。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溫度對羅非魚皮明膠得率的影響

如圖1所示,提取溫度從30 ℃上升到90 ℃時,明膠得率隨溫度的升高而增加,這一結(jié)果與大西洋鮭魚皮[15]和波羅的海鱈魚骨骼、三文魚魚皮[13]的結(jié)果一致,但在提取溫度為60～80 ℃時,溫度對于明膠得率無顯著影響(p>0.05)。當(dāng)提取溫度為90 ℃時，明膠提取率達(dá)到最大，為62.60%±0.84%。更高的提取溫度可以提供更高的能量破壞皮膚中膠原蛋白的氫鍵[16],因此,隨著提取溫度的升高,膠原蛋白分子內(nèi)及分子間的化學(xué)鍵斷裂的更多、更徹底,致使膠原蛋白變性到更高的程度,明膠的得率升高。

圖1 提取溫度對羅非魚魚皮明膠得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of gelatin from tilapia skin注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),下同。

2.2 羅非魚皮明膠的SDS-PAGE分析

由圖2可知,提取溫度為30、40、50 ℃時,明膠亞基結(jié)構(gòu)保持比較完整,由α1、α2、β3條肽鏈組成,提取溫度為60 ℃時,明膠分子斷裂成更小的片段,分子質(zhì)量下降,電泳條帶開始模糊;提取溫度為70、80、90 ℃時,電泳條帶不明顯。提取溫度較低時,明膠分子少數(shù)螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解體,大分子組分無法溶出;適當(dāng)升溫時,較多的膠原化學(xué)鍵被破壞,釋放出更多大分子亞基;溫度過高導(dǎo)致膠原螺旋結(jié)構(gòu)過度解體,明膠分子斷裂成更小的片段[17],分子質(zhì)量過低無法在圖譜中顯示。

圖2 不同提取溫度提取的羅非魚魚皮明膠的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE patterns of gelatin from tilapia skin at different extraction temperatures

2.3 提取溫度對羅非魚皮明膠凝凍強(qiáng)度的影響

凝凍強(qiáng)度是衡量明膠質(zhì)量優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)。由圖3可知,凝凍強(qiáng)度隨提取溫度的升高先增大后減小,在50 ℃凝凍強(qiáng)度達(dá)到最大值(884.33±26.76) g,在90 ℃獲得最低的凝凍強(qiáng)度,這一結(jié)果與白鰱魚皮明膠[17]接近,方差分析結(jié)果表明,提取溫度對于明膠的凝凍強(qiáng)度有顯著影響(p<0.05)。

圖3 提取溫度對羅非魚魚皮明膠凝凍強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the gel strength of gelatin from tilapia skin

明膠的凝凍強(qiáng)度主要與明膠的亞氨基酸、羥脯氨酸含量及分子量分布有關(guān)。明膠中亞氨基酸含量越高,凝凍強(qiáng)度越大。提取溫度較低時,只有部分氫鍵被破壞,明膠三螺旋結(jié)構(gòu)保持較完整。適當(dāng)升溫,膠原螺旋解體暴露出更多的極性基團(tuán),釋放出更多明膠大分子亞基(尤其是α組分),明膠分子與水分子充分結(jié)合,致使明膠的分子鏈變長,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更堅固,形成的膠凝體的凝凍強(qiáng)度越大[17]。提取溫度過高時,膠原亞基組分被降解,明膠分子鏈變短,形成的膠凝體內(nèi)部作用力變小,明膠的凝凍強(qiáng)度降低[18]。因此,低水解的明膠可能含有更長的鏈,鏈與鏈之間更容易交互形成強(qiáng)大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)從而得到更高的凝凍強(qiáng)度。

2.4 提取溫度對羅非魚皮明膠紫外吸收光譜的影響

由于蛋白質(zhì)分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸,在250～290 nm范圍內(nèi)有最大吸收。但明膠中含有少量的芳香族氨基酸,使其在這個范圍內(nèi)基本無吸收峰。而明膠肽鏈存在C=O、-CONH2、-COOH 等生色基團(tuán),所以紫外吸收峰通常會出現(xiàn)在220 nm左右[19]。如圖4所示,不同提取溫度下提取的明膠溶液紫外吸收區(qū)范圍在190～230 nm內(nèi),紫外吸收峰都在208 nm左右,與陳小雷[11]的結(jié)果類似,這是肽鍵中酰胺鍵的特征吸收峰,是蛋白質(zhì)的共有特性[20]。由圖4可以看出,提取溫度對于羅非魚皮明膠的紫外吸收光譜的影響很小,幾種魚皮明膠的紫外吸收峰峰形一致,峰值大小有微小區(qū)別。

圖4 提取溫度對羅非魚魚皮明膠的紫外吸收光譜的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the ultraviolet absorption of gelatin from tilapia skin

2.5 提取溫度對羅非魚皮明膠紅外光譜性質(zhì)的影響

由圖5可知,不同溫度下提取的明膠樣品各峰形一致,均具有蛋白質(zhì)特征的酞胺帶吸收和側(cè)鏈基團(tuán)吸收的特征峰,即酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ吸收峰。不同溫度下提取的魚皮明膠的酰胺A譜帶出峰位置都在3433.96 cm-1左右,而這個譜帶主要是由N-H的伸縮振動或O-H的伸縮振動引起的。酰胺I譜帶出峰位置都在1653.62 cm-1左右,符合酰胺I帶的常見頻率范圍(1600～1700 cm-1),該譜帶主要與多肽主鏈上的羰基(C=O)伸縮振動有關(guān)[21-22]。酰胺Ⅱ帶的吸收峰出現(xiàn)在1547 cm-1左右,是由C-H振動或N-H振動引起的[23]。酰胺Ⅲ的吸收峰通常位于1300～1200 cm-1這部分結(jié)構(gòu)與膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)[24]。提取溫度為30、40、50、60 ℃時,魚皮明膠在1240 cm-1處出現(xiàn)酰胺Ⅲ帶的吸收峰,而提取溫度為70、80、90 ℃時,酰胺Ⅲ 帶在1238 cm-1處出現(xiàn)吸收峰,而羅非魚皮膠原蛋白的酰胺Ⅲ帶吸收峰位于1240cm-1處[25],說明提取溫度較高時三螺旋結(jié)構(gòu)部分破壞。

圖5 提取溫度對羅非魚魚皮明膠的紅外性質(zhì)的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the FTIR spectra of gelatin from tilapia skin

2.6 提取溫度對羅非魚皮明膠熱變性溫度的影響

明膠的熱變性是指膠原蛋白受熱導(dǎo)致三螺旋結(jié)構(gòu)的次級鍵斷裂形成無規(guī)則的單鏈線團(tuán)結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致膠原蛋白失去原有的性質(zhì)[26]。亞氨基酸的含量影響明膠的熱穩(wěn)定性,亞氨基酸含量越多,其三螺旋結(jié)構(gòu)就越穩(wěn)定[27-28],Ikoma等[29]也曾報道,存在脯氨酸和羥脯氨酸中的吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)有助于穩(wěn)定膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)。

從圖6中可以看出,不同溫度條件下所提取的魚皮明膠的熱變性溫度分別為(101.05±2.97)、(104.35±3.54)、(107.59±0.37)、(97.80±4.21)、(95.35±2.60)、(92.52±3.15)、(89.66±1.23) ℃,提取溫度為50 ℃的魚皮明膠的熱變性溫度最高,提取溫度高于50 ℃時,魚皮明膠的熱變性溫度逐漸降低。提取溫度較低時,明膠含有較長的鏈，從而需要較高的溫度提供較高的能量破壞明膠中的三螺旋結(jié)構(gòu)[30],隨著溫度的升高,明膠分子降解的更為徹底,三螺旋結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定,較低的溫度就可使之變性,所以熱變性溫度降低。提取溫度為30 ℃時,可能是由于溫度較低導(dǎo)致魚皮中的明膠提取不充分,熱變性溫度略低于提取溫度為50 ℃的羅非魚魚皮明膠。

圖6 提取溫度對羅非魚魚皮明膠的熱變性溫度的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on thermal denaturation temperature of gelatin from tilapia skin

2.7 提取溫度對羅非魚皮明膠流變學(xué)性能的影響

明膠中脯氨酸和羥脯氨酸的含量較高,在明膠內(nèi)部交聯(lián)過程中能夠增加有序結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。明膠具有一定的黏彈性,G′為儲能模量或彈性模量,G″為損耗模量或黏性模量。如圖7所示,隨著掃描頻率的增大,不同提取溫度下所提取的魚皮明膠的彈性模量、黏性模量都呈上升趨勢,G′和G″的斜率逐漸減小。斜率變化小,代表明膠的內(nèi)部交聯(lián)越強(qiáng),凝膠穩(wěn)定性越好[31]。30、40 ℃提取的明膠在掃描頻率較低時黏彈性斜率變化較大,凝膠穩(wěn)定性較差。50、60、70 ℃條件下提取的魚皮明膠的G′和G″的數(shù)值較為接近,80、90 ℃條件下提取的魚皮明膠的G′和G″的數(shù)值略低70 ℃提取的明膠。G′和G″的數(shù)值越高,代表明膠內(nèi)部交聯(lián)越強(qiáng),內(nèi)部貯藏的能量越多。而隨著剪切頻率的升高,魚皮明膠的彈性模量和黏性模量幾乎不再變化,呈現(xiàn)牛頓流體的性質(zhì)。提取溫度高于50 ℃時斜率有所波動,可能是由于提取溫度升高導(dǎo)致明膠分子質(zhì)量變小,三螺旋結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,明膠內(nèi)部交聯(lián)變少,內(nèi)部貯藏的能量變小,流變性能變差。

圖7 不同提取溫度提取的魚皮明膠的頻率掃描流變曲線Fig.7 Frequency sweep curves of gelatin from tilapia fish skin at different extraction temperatures

3 結(jié)論

本實驗分析對比了不同提取溫度對羅非魚皮明膠理化性質(zhì)的影響。結(jié)果表明:羅非魚皮明膠得率隨提取溫度的升高而升高,在提取溫度為60～80 ℃差異不顯著(p<0.05);SDS-PAGE圖譜顯示,當(dāng)提取溫度低于50 ℃時,所提取的魚皮明膠的亞氨基組分保持較完整,由α1、α2、β3 條肽鏈組成,當(dāng)提取溫度高于60 ℃時,明膠分子降解成小分子組分,電泳條帶較模糊;凝凍強(qiáng)度在提取溫度為50 ℃時達(dá)到最大值(884.33±26.76) g;紫外吸收光譜顯示,羅非魚魚皮明膠的芳香族氨基酸含量較少,紅外光譜有微小差異,但都顯示出了膠原蛋白的振動模式;熱變性溫度隨提取溫度的升高先增大后減小,在50 ℃達(dá)到最大值;提取溫度通過改變明膠的分子量大小影響明膠溶液內(nèi)部貯藏能量的多少,進(jìn)而對明膠溶液的流變性能產(chǎn)生影響。以上結(jié)果表明,提取溫度通過改變明膠的分子量分布繼而對魚皮明膠的凝凍強(qiáng)度、熱變性溫度、流變性能等理化性質(zhì)產(chǎn)生影響,本研究結(jié)果可為羅非魚魚皮的高值化利用和魚皮明膠的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。