楊海玲，賴少鳳，農(nóng)海妮，劉彥婷，胡昌江

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都610072；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530001）

廣山楂為薔薇科蘋果屬植物臺(tái)灣林檎Malusdoumeri（Bois.）Chev.或光萼林檎 Malusleiocalyca S.Z.Hunag的干燥成熟果實(shí)，其性味酸、甘、澀，微溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，具有消食健胃，行氣散瘀的功效，可用于肉食積滯，胃脘脹滿，瀉痢腹痛，瘀血經(jīng)閉，產(chǎn)后瘀阻，心腹刺痛，疝氣疼痛，高脂血癥等。廣山楂在廣西地區(qū)作為臨床常用藥物，已有90多年歷史，有生用、炒黃、炒焦、炒炭、酒炙、鹽炙等多種炮制方法[1]。廣山楂中含有黃酮、有機(jī)酸、萜類、甾醇類等多種成分[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，兒茶素具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等作用[4-8]，柚皮苷則具有促進(jìn)骨細(xì)胞增殖和分化成熟[9-10]、抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡作用[11]等多方面生物活性。根皮苷具有抗癌、抗病毒、抗氧化等作用[12-15]。近年來，有學(xué)者比較了不同產(chǎn)地的廣山楂中蘆丁[16]、金絲桃苷含量[17]，但對(duì)于廣山楂及其不同炮制品中兒茶素、柚皮苷、根皮苷等3種活性成分含量的研究，鮮見有文獻(xiàn)報(bào)道?；诖朔N情況，本研究擬對(duì)廣山楂中上述3種主要化學(xué)成分含量進(jìn)行研究，為探討廣山楂及其炮制方法的科學(xué)性及臨床合理使用提供科學(xué)參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-1260AT高效液相色譜分析儀（G1315D DAD檢測器，G1311C四元泵，G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，Agilent ChemStation色譜工作站）：美國安捷倫公司；SHIMADZU VP-ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：島津-GL（上海）商貿(mào)有限公司；SQP 型電子分析天平：德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 藥材

廣山楂采集于桂林市平樂縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)梁子寧副教授鑒定，為薔薇科蘋果屬植物臺(tái)灣林檎Malusdoumeri（Bois.）Chev.的干燥成熟果實(shí)。

1.3 試劑

兒茶素、柚皮苷、根皮苷對(duì)照品（純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）：成都艾特姆生物科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純）：賽默飛世爾（中國）有限公司；實(shí)驗(yàn)用純凈水，其他試劑均為分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 廣山楂不同炮制品制備

生品：取廣山楂飲片，放入40℃的烘箱中烘10 h，取出放涼，即得。

炒黃品：取凈廣山楂飲片100 g，置預(yù)熱的電炒鍋內(nèi)，中火（1 500 W）加熱，連續(xù)加熱5 min，炒至表面淺黃色，取出，晾涼，稱重，即得，收率為94.29%（收率/%=炮制后合格品質(zhì)量（g）/生品質(zhì)量（g）×100）。

炒焦品：取凈廣山楂飲片100 g，置預(yù)熱的電炒鍋內(nèi)，中火（1 500 W）加熱，連續(xù)加熱6 min，炒至表面焦黃色，略見焦斑，取出，晾涼，稱重，即得，收率為92.86%（收率/%=炮制后合格品質(zhì)量（g）/生品質(zhì)量（g）×100）。

炒炭品：取凈廣山楂飲片100 g，置預(yù)熱的電炒鍋內(nèi)，武火（2 100 W）加熱，連續(xù)加熱9 min，炒至表面焦黑色，內(nèi)部焦褐色，取出，晾涼，稱重，即得，收率為75%（收率/%=炮制后合格品質(zhì)量（g）/生品質(zhì)量（g）×100）。

酒炙品：取凈廣山楂飲片100 g，加入黃酒20 g（加適量水稀釋），悶潤，待溶液吸盡后，置預(yù)熱的電炒鍋內(nèi)，武火（600 W）加熱，連續(xù)加熱10 min，炒至表面近干，取出，晾涼，稱重，即得，收率為95.20%（收率/%=炮制后合格品質(zhì)量（g）/生品質(zhì)量（g）×100）。

鹽炙品：取凈廣山楂飲片100 g，加入食鹽2 g，加適量水稀釋，悶潤，待溶液吸盡后，置預(yù)熱的電炒鍋內(nèi)，武火（600 W）加熱，連續(xù)加熱10 min，炒至表面近干，取出，晾涼，稱重，即得，收率為98.7%（收率/%=炮制后合格品質(zhì)量（g）/生品質(zhì)量（g）×100）。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取兒茶素對(duì)照品242.0 mg、柚皮苷對(duì)照品8.0 mg、根皮苷對(duì)照品13.3 mg，置于同一50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度。精密量取上述對(duì)照品溶液 0.5、1.5、2.5、5、7.5、10 mL 至量瓶中，加甲醇定容至10 mL，即得。

2.3 供試品溶液的制備

分別精密稱取各樣品粉末（65目）1.0 g，精密加入甲醇20 mL，稱重，回流提取2 h，放冷，補(bǔ)足重量，過濾，取濾液適量，離心冷藏備用。

2.4 色譜條件

色譜柱 SHIMADZU，VP-ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序（0～5 min，6%～6%B，5.1 min～15 min，6%～10%B；15.1 min～27 min，10%～17%B；27.1 min～50 min，17%～38%B ；50.1 min～60 min，38%～52%B）；流速0.8 mL/min；紫外檢測波長為 285 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量 10 μL。

2.5 線性關(guān)系的考察

分別精密吸取兒茶素、柚皮苷、根皮苷混合對(duì)照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，依法測定，以對(duì)照品的進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2”對(duì)照品溶液 10 μL，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各峰峰面積RSD。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一樣品（生品）粉末（65目）1.0 g，平行6份，按“2.3”項(xiàng)下的制備方法制備溶液，依法測定，即得。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取廣山楂（生品）溶液 10 μL，分別在 0、1、4、8、12、24 h進(jìn)樣，分別考察3種成分的穩(wěn)定性，即得。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量樣品（生品）粉末6份，每份約0.5 g，精密稱定。采用加樣回收試驗(yàn)，分別精密加入適量兒茶素、柚皮苷、根皮苷對(duì)照品，精密稱定。依“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下條件測定，即得。

2.10 樣品含量測定

取各炮制品粉末（65目）各1.0 g，平行3份，按“2.3”項(xiàng)下制備各供試品溶液，分別吸取各樣品10 μL，依法進(jìn)樣進(jìn)行測定，計(jì)算各自樣品含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性關(guān)系的考察

按照“2.5”項(xiàng)下方法，進(jìn)行線性關(guān)系考察，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，各成分在各自濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

表1 廣山楂中3種有效成分線性關(guān)系考察Table 1 Investigation of linear relation of three ingredients in Malusdoumeri（Bois.）Chev

3.2 精密度試驗(yàn)

按照“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行的精密度試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 2 The results of accuracy test（n=6）

結(jié)果兒茶素、柚皮苷、根皮苷峰面積的RSD分別為1.33%、1.65%、2.81%，表明該方法測定結(jié)果的儀器精密度良好。

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表3。

結(jié)果兒茶素含量為3.70 mg/g，RSD為0.95%；柚皮苷含量為2.54 mg/g，RSD為2.35%；根皮苷含量0.37 mg/g，RSD為0.88%，結(jié)果表明本研究建立方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 The results of repetitive testing（n=6）

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表4。

結(jié)果兒茶素、柚皮苷、根皮苷峰面積RSD分別為1.34%、1.68%、2.56%，試驗(yàn)結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 加樣回收率試驗(yàn)

加樣回收試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 4 The results of stability test（n=6）

表5 兒茶素、柚皮苷、根皮苷的加樣回收率試驗(yàn)（n=6）Table 5 The sample recovery experiment of catechin，naringin and phlorizin（n=6）

結(jié)果如表5所示，結(jié)果兒茶素、柚皮苷、根皮苷的平均回收率分別是100.34%、100.19%、99.89%；RSD依次為0.85%、1.04%、1.61%。

3.6 樣品含量測定

廣山楂不同炮制品兒茶素、柚皮苷、根皮苷的含量測定結(jié)果見表6。

由表6可以看出各炮制品中兒茶素含量如下：炒焦品（14.23 mg/g）＞鹽炙品（12.53 mg/g）＞炒黃品（7.35 mg/g）＞炒炭品（7.23 mg/g）＞酒炙品（5.12 mg/g）＞生品（3.71 mg/g）；柚皮苷含量為：酒炙品（6.18 mg/g）＞炒焦品（5.35 mg/g）＞鹽炙品（4.66 mg/g）＞炒黃品（3.26 mg/g）＞生品（2.54mg/g）＞炒炭品（1.87mg/g）。根皮苷含量依次是：鹽炙品（0.98 mg/g）＞炒焦品（0.82 mg/g）＞酒炙品（0.76 mg/g）＞炒黃品（0.43 mg/g）＞生品（0.37 mg/g）＞炒炭品（0.27 mg/g）。廣山楂不同炮制品HPLC色譜圖見圖1。

圖1 廣山楂不同炮制品HPLC色譜圖Fig.1The HPLC of Malusdoumeri（Bois.）Chev before and after being processed

由圖1可以看出，在廣山楂各不同炮制品在色譜圖相應(yīng)的位置均能檢測到兒茶素、柚皮苷和根皮苷的對(duì)照品色譜峰，結(jié)果表明廣山楂的不同炮制品中均含有上述3種活性成分，且得到了較好的分離，相鄰峰間分離度均大于1.5。

4 結(jié)論

廣山楂是一種以果實(shí)為入藥部位，也是一種藥食兩用的藥材，在廣西地區(qū)作山楂使用已有近百年歷史。目前，在現(xiàn)行的廣西壯族自治區(qū)中藥飲片炮制規(guī)范（2007）中收載了炒黃、炒焦、炒炭等多種炮制方法[1]，但尚未建立廣山楂飲片指標(biāo)性成分含量測定方法與標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其飲片質(zhì)量控制將產(chǎn)生不利影響。因此本研究首次采用HPLC比較了廣山楂及其不同炮制品中兒茶素、柚皮苷、根皮苷3種成分含量。由表6可看出，各炮制品中兒茶素含量高低順序?yàn)椋焊髋谥破分袃翰杷睾咳缦拢撼唇蛊罚?4.23 mg/g）＞鹽炙品（12.53 mg/g）＞炒黃品（7.35 mg/g）＞炒炭品（7.23 mg/g）＞酒炙品（5.12 mg/g）＞生品（3.71 mg/g）；進(jìn)一步分析廣山楂不同炮制品中兒茶素含量，發(fā)現(xiàn)不同炮制品中尤以炒焦和鹽炙法炮制后含量為高，分別約為生品的3.8倍和3.4倍；炒黃品、炒炭品、酒炙品含量分別為生品1.98、1.94、138倍。該結(jié)果說明，炮制可提高兒茶素含量。這可能與糖類成分在加熱的條件，轉(zhuǎn)化形成兒茶素有關(guān)，其轉(zhuǎn)化機(jī)理有待進(jìn)一步研究。柚皮苷含量為酒炙品＞炒焦品＞鹽炙品＞炒黃品＞生品＞炒炭品。根皮苷含量則為鹽炙品＞炒焦品＞酒炙品＞炒黃品＞生品＞炒炭品。經(jīng)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，酒炙、鹽炙、炒焦、炒黃的炮制方法均提高柚皮苷、根皮苷含量，生品次之，分析原因，可能與柚皮苷和根皮苷同屬于黃酮苷類物質(zhì)，藥物中存在的相應(yīng)水解酶使部分苷類成分發(fā)生水解，從而使生品含量較低。而炒炭法炮制后樣品含量最低，這可能與其炒炭時(shí)溫度高、時(shí)間長有關(guān)。該研究結(jié)果提示加熱和加輔料炮制可起到一定的“殺酶保苷”作用，但此3種化學(xué)成分含量的變化是否是其傳統(tǒng)功效發(fā)生改變的物質(zhì)基礎(chǔ)，值得進(jìn)一步結(jié)合相關(guān)的藥理藥效指標(biāo)進(jìn)行深入研究，以期為其不同炮制品的臨床合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

本研究結(jié)果表明不同炮制方法對(duì)廣山楂的3種化學(xué)成分產(chǎn)生了一定影響，鹽炙等炮制方法可提高樣品中兒茶素、柚皮苷、根皮苷含量，炒炭法則使柚皮苷、根皮苷含量降低，可為廣山楂的研究提供一定參考。