張宏偉，莎日娜，鄭文杰，王碩

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300461；3.天津醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，天津300222）

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica），是腸桿菌科、耶爾森菌屬的一個(gè)種，廣泛分布于自然界的土壤、水體中，野生動(dòng)物，家畜，昆蟲中均有檢出，生存溫度從0℃～40℃，在0℃～40℃環(huán)境中保持生命力可達(dá)18個(gè)月之久，-25℃能存活24 h以上，這種嗜冷性質(zhì)決定了保存在4℃～5℃冰箱中的食品更具有傳染的危險(xiǎn)性。

小腸結(jié)腸炎葉爾森氏菌是一種急性胃腸炎型食物中毒病原菌，可致人畜患病。耶爾森氏菌病典型癥狀為胃腸炎、發(fā)熱，亦可引起闌尾炎和反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎，另一個(gè)并發(fā)癥是敗血癥，死亡率較高。經(jīng)典檢測方法耗時(shí)長，步驟繁多，操作復(fù)雜，成本高昂，不能滿足快速鑒定食品中是否污染該菌的要求，本研究旨在應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)建立檢測方法，結(jié)合免疫金試紙條檢測方法，避免PCR方法結(jié)果檢測需要電泳使用溴化乙錠（ethidium bromide，EB）、PCR產(chǎn)物污染等問題，探索建立一種快速準(zhǔn)確避免污染的檢測方法，便于在實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

基因組提取試劑盒：Promega公司；HS Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL）：大連寶生物公司；引物合成由上海生物工程公司完成；核酸快速檢測試紙條：優(yōu)思達(dá)公司。

菌株采用4株美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）菌株和22株中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（national center for medical culture collections，CMCC）小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，9株其它耶爾森氏菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌和其它菌屬17株ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株，具體見表1。

表1 試驗(yàn)菌株Table 1 Bacterial strains for detection

1.2 儀器與設(shè)備

PrC-200熱循環(huán)儀：MJ公司；1510核酸蛋白分析儀：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

利用細(xì)菌16s-23srDNA間區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物見表2，引物組合見表3。在引物合成時(shí)，一條引物的5’端標(biāo)記異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC），另一條引物的 5’端標(biāo)記地高辛（Digoxin）。

表2 引物序列Table 2 Primers sequence

表3 16s-23s rDNA間區(qū)引物組合Table 3 Detection primer combination

1.3.2 反應(yīng)體系

體系的構(gòu)成如下：10×buffer，5 μL；引物（10 μmol/L）各 2 μL；dNTP（10 mmol/L），1 μL；模板 DNA，2 μL；Taq酶（5 U/μL），1 μL；ddH2O，37 μL。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min；擴(kuò)增循環(huán)：94℃30 s，56℃溫度退火 15 s，72℃延伸 60 s，進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保存。

1.3.3 特異性試驗(yàn)

利用表1中的標(biāo)準(zhǔn)菌株對引物分別進(jìn)行特異性試驗(yàn)，以篩選出通用性好，特異性強(qiáng)的引物。

1.3.4 靈敏度試驗(yàn)

取1 mL標(biāo)準(zhǔn)菌株增菌液用于提取基因組DNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測DNA質(zhì)量及純度。將PCR模板進(jìn)行10倍梯度稀釋，按建立方法擴(kuò)增，同時(shí)用凝膠電泳和膠體金試紙條方法觀察檢測結(jié)果。

1.3.5 樣品加菌試驗(yàn)

3份經(jīng)證實(shí)未污染結(jié)腸炎耶爾森氏菌的碎肉樣品，1份作為對照樣品，2份各25 g分別接種1 mL不同濃度小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌液和1 mL 10倍濃度的大腸埃希菌和金葡菌菌液，混勻后進(jìn)行檢測。

1.3.6 市售樣品檢測

利用建立的方法對市場購買的樣品進(jìn)行檢測，并與GB 4789.8-2016《食品安全國家標(biāo)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性引物的確定

應(yīng)用溫度梯度PCR，分別用9對引物進(jìn)行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)S1/A2引物組合在56℃退火時(shí)特異性最好，實(shí)驗(yàn)用近緣菌株都無假陽性出現(xiàn)，而小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌都出現(xiàn)特異性泳帶。因此，本研究選擇S1/A2作為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌PCR檢驗(yàn)的特異性引物，退火溫度確定為56℃，其擴(kuò)增產(chǎn)物為282 bp。

2.2 特異性試驗(yàn)

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測結(jié)果均為陽性結(jié)果，耶爾森氏菌其他屬標(biāo)準(zhǔn)菌株及對照標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測結(jié)果均為陰性，部分檢測結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 特異性檢測結(jié)果Fig.1 Detece of specificity by electrophoresis

圖2 對照菌株特異性檢測結(jié)果Fig.2 Detece of specificity by nucleic acid strips

檢測結(jié)果顯示小腸結(jié)腸炎標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測沒有出現(xiàn)假陰性結(jié)果，耶爾森氏菌屬其他種的標(biāo)準(zhǔn)菌株及對照標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測均沒有出現(xiàn)假陽性結(jié)果，說明引物特異性良好，試紙條顯示的檢測結(jié)果與電泳結(jié)果相符合，表明其檢測特異性良好。

2.3 靈敏度試驗(yàn)

模板稀釋倍數(shù)分別為 100、10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7μg/mL，檢測結(jié)果見圖 3。

圖3 靈敏度檢測結(jié)果Fig.3 Detece of sensitivity

檢測結(jié)果表明，隨著稀釋度的增加，檢測條帶逐漸減弱，當(dāng)稀釋濃度達(dá)到10-3μg/mL時(shí)，電泳檢測結(jié)果顯示為陰性，而試紙條則有淡紅色條帶出現(xiàn)，說明試紙條檢測靈敏度較電泳方法高一個(gè)數(shù)量級(jí)，可達(dá)到10-3μg/mL。

2.4 樣品加菌試驗(yàn)

添菌靈敏度檢測結(jié)果見圖4。

圖4 添菌靈敏度檢測結(jié)果Fig.4 Detece of sensitivity in samples

檢測結(jié)果表明，盡管有高濃度的干擾菌存在，電泳檢測靈敏度可達(dá)到101CFU/mL，而試紙條檢測靈敏度較電泳檢測高一個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到了100CFU/mL。

2.5 市售樣品檢測

用PCR-試紙條法對市售722份水產(chǎn)及禽畜肉進(jìn)行檢測，并與國標(biāo)方法檢測結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表4。

表4 市售樣品檢測結(jié)果Table 4 Detection result of samples

檢測結(jié)果表明，PCR-試紙條方法檢測陽性率高于國標(biāo)方法。以國標(biāo)方法為基準(zhǔn)方法，對新建立的方法進(jìn)行評估，見表5。

表5 PCR-試紙條方法評估表Table 5 Assessment of PCR-immunoblotting strips method

3 討論

檢測假陽性的發(fā)生可能因素包括：（1）如果檢測中多對引物相互反應(yīng)，出現(xiàn)引物二聚體則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。（2）樣品中存在目標(biāo)菌死菌，作為較為靈敏的核酸檢測方法，檢測到死菌信號(hào)。（3）傳統(tǒng)的檢測方法對檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)要求較高，如果檢驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)不足，則使用經(jīng)典檢測方法有可能造成漏檢。使用PCR-試紙條方法作為篩選方法，可以彌補(bǔ)檢驗(yàn)人員因經(jīng)驗(yàn)不足造成的漏檢情況。以本研究建立的快速方法檢測到陽性結(jié)果，需要用國標(biāo)方法加以確認(rèn)，以國標(biāo)方法檢測作為判定依據(jù)。

國家標(biāo)準(zhǔn)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌耶爾森氏檢測方法至少需要7天完成檢測、容易發(fā)生檢測人員因經(jīng)驗(yàn)不足造成漏檢，采用本研究建立的檢測方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，可在24小時(shí)內(nèi)得到檢測結(jié)果。本研究采用試紙條代替凝膠電泳，既減少了PCR產(chǎn)物的二次污染，又避免了EB對人體的傷害和對環(huán)境的污染，是傳統(tǒng)方法的有益補(bǔ)充。