王紅松，魏大廈，戴曉婷，王 婷，陳衛(wèi)東

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012)

中醫(yī)理論認(rèn)為皮膚的色斑主要是由于肝郁血瘀、脾虛濕蘊(yùn)、腎精虧虛、沖任失調(diào)等原因引起的，可通過服用具有疏肝解郁、健脾化濕、滋補(bǔ)腎精、調(diào)理沖任、養(yǎng)血活血等作用的中草藥來減少色素沉著。苓術(shù)芍丹湯為筆者多年跟師學(xué)習(xí)并結(jié)合自身臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)所得，主要由茯苓、白術(shù)、白芍、丹參、紅景天、當(dāng)歸、甘草7味藥物組成，具有健脾化濕、益氣養(yǎng)血、活血化瘀等作用，從而發(fā)揮祛斑美白的功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，黑色素的含量和分布影響皮膚的顏色[1]，黑色素形成的關(guān)鍵酶為酪氨酸酶，故抑制酪氨酸酶的活性可以減少黑色素形成，從而達(dá)到美白效果。此外，黑色素的形成與細(xì)胞內(nèi)外的氧化反應(yīng)有關(guān)，因此抗氧化中藥也具有美白功能[2-3]。酪氨酸酶抑制率試驗(yàn)主要優(yōu)點(diǎn)為操作簡便、高效，可成為初步篩選美白類藥物的方法。1，1-二苯基-2-苦基肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基抑制率試驗(yàn)具有靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，因此常用于中藥材抗氧化活性的測定[4]。尤卓瑩和黃永紅等[5-6]均采用生化酶學(xué)法和DPPH分析法綜合評價(jià)四物湯和當(dāng)歸補(bǔ)血湯的美白功效。故本研究以苓術(shù)芍丹湯作為研究對象，對酪氨酸酶的抑制率采用生化酶學(xué)法測定，抗氧化活性采用DPPH分析法檢測，以酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率的綜合評分為美白功效的評價(jià)指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選苓術(shù)芍丹湯的最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 R-100N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州市長城科工貿(mào)有限公司；PL601-S型千分之一電子天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；AB135-S型1/10萬電子天平：德國Mettler Toledo公司；XW-80A微型旋渦混合儀：上海滬西儀器有限公司；SPECORD-S600紫外分光光度計(jì)：德國耶拿分析儀器股份公司。

1.2 試藥 茯苓(批號 17080101)、白術(shù)(批號 1701171)、白芍(批號 1710191)、丹參(批號 170408)、紅景天(批號 1712082)、當(dāng)歸(批號 1706031)、甘草(批號 1709016)：均購自安徽普仁中藥飲品有限公司；酪氨酸酶：Sigma公司；L-多巴胺：上海伊卡生物技術(shù)有限公司；混合磷酸鹽：上海虹北試劑有限公司；DPPH：上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純級別。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 DPPH自由基溶液的配制 精確稱取一定量的DPPH，加入一定量的無水乙醇制備成濃度為0.01 mg/mL的溶液，避光保存在4 ℃環(huán)境中。

2.1.2 磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)的配制 取一袋混合磷酸鹽倒入容量瓶中，根據(jù)說明書要求加入250 mL水，配制PBS溶液(pH=6.8)，放置常溫保存，備用。

2.1.3 酪氨酸酶溶液的配制 精確稱取酪氨酸酶，用已配制好的PBS溶液配制成約200 U/mg的酪氨酸酶溶液，-20 ℃冷凍保存，用之前放置于4 ℃下解凍。

2.1.4 L-多巴胺溶液的配制 精密稱取一定量的L-多巴胺，先用少量的0.1 mol/L鹽酸完全溶解，然后再加已配制好的適量PBS溶液配制L-多巴胺溶液，使其終濃度為1.5 mg/mL，避光冷藏保存在4 ℃條件下。

2.2 苓術(shù)芍丹湯美白功效的評價(jià)

表1 用于檢測酪氨酸酶抑制率的反應(yīng)液組成

2.3 正交試驗(yàn) 由單因素考察結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以料液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)和提取次數(shù)(D)為試驗(yàn)因素，按L9(34)正交表進(jìn)行平行操作試驗(yàn)。因素、水平表見表3。

表2 用于測定DPPH自由基清除率的反應(yīng)液組成

表3 正交試驗(yàn)因素水平表

稱取茯苓、白術(shù)、白芍各15 g，丹參、當(dāng)歸、紅景天各10 g，甘草5 g，以70%乙醇為提取溶劑，按照正交試驗(yàn)因素水平表制備苓術(shù)芍丹湯的供試液，按“2.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行美白功效的評價(jià)，并對結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4和表5。

表4 正交試驗(yàn)分析結(jié)果

注：美白度=酪氨酸酶抑制率×0.5+DPPH自由基清除率×0.5

表5 方差分析結(jié)果

注：F0.05(2，2)=19

由表4可知，基于單因素考察和正交試驗(yàn)結(jié)果，各因素對提取效果影響的順序依次為：提取溫度、提取次數(shù)、料液比、提取時間，表5顯示提取溫度和提取次數(shù)這兩個因素對提取工藝的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故綜合直觀分析結(jié)果和方差分析結(jié)果確定苓術(shù)芍丹湯的最佳提取條件為A3B3C2D1，即料液比為1∶7 g/mL，提取時間為1.5 h，提取溫度為80 ℃，提取1次。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 為了驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性和真實(shí)性，保證優(yōu)選得到的為最佳、合理的提取工藝。采用A3B3C2D2組合作為提取工藝，制備苓術(shù)芍丹湯的供試液，平行制備3份，按“2.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行美白功效的評價(jià)，結(jié)果酪氨酸酶抑制率為97.31%(n=3，RSD=1.27%)，DPPH自由基清除率為92.92%(n=3，RSD=1.88%)，美白功效為95.11%(n=3，RSD=0.99%)。結(jié)果表明優(yōu)化篩選后的提取方法合理、穩(wěn)定、可行、準(zhǔn)確，且具有可操作性和重現(xiàn)性。

3 討論

本研究以酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率為美白功效的評價(jià)指標(biāo)優(yōu)選苓術(shù)芍丹湯的最佳提取工藝。在單因素考察試驗(yàn)中，對料液比、提取時間、提取溫度、提取次數(shù)、提取溶劑進(jìn)行考察，其中在對不同的溶劑(水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇)考察時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇濃度不高于70%時，美白度與乙醇濃度呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時，美白度達(dá)到飽和狀態(tài)，所以在試驗(yàn)中選擇70%乙醇作為提取溶劑。通過正交試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以7倍的70%乙醇在80 ℃下對苓術(shù)芍丹湯進(jìn)行加熱回流提取1次，每次1.5 h時，美白功效達(dá)到最佳。該工藝合理、穩(wěn)定，為苓術(shù)芍丹湯的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支撐，也為其進(jìn)一步研究提供依據(jù)。