祝媛玥，譚子虎

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430061；3.湖北省中醫(yī)藥研究院，湖北 武漢 430074)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是一種獲得性認(rèn)知功能障礙性疾病，主要由腦血管病及其危險(xiǎn)因素引起[1]。近年來，在老年人中，VD的臨床發(fā)病率僅次于老年性癡呆，是一種多發(fā)且難以治愈的疾病，其社會危害性不容忽視，缺血性腦血管病在其發(fā)病原因中居于首位，腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡、壞死是其最常見的病理學(xué)機(jī)制[2]。海馬是與認(rèn)知功能相關(guān)的重要結(jié)構(gòu)，參與學(xué)習(xí)和記憶，其神經(jīng)細(xì)胞對缺血非常敏感，有選擇易感性，當(dāng)缺血反復(fù)發(fā)生時(shí)海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡可引起認(rèn)知功能障礙[3]。糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)是GSK-3(一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶)的亞型之一，參與多條控制細(xì)胞凋亡的傳導(dǎo)路徑，在VD神經(jīng)細(xì)胞損傷中促細(xì)胞凋亡[4]。細(xì)胞周期蛋白-D1(Cyclin D1)是GSK-3β的下游分子，通過對細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換的調(diào)控，對細(xì)胞增殖過程有啟動(dòng)作用[5-6]，有多種調(diào)節(jié)因子可調(diào)節(jié)Cyclin D1表達(dá)，如ERα-E2、NF-κB、FOXO3a。

加減薯蕷丸是湖北省名老中醫(yī)呂繼端根據(jù)《金匱要略》薯蕷丸化裁而來，該方脾腎同調(diào)、生精化髓、補(bǔ)腎益腦、開竅益智，有改善認(rèn)知功能的作用[7-8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，加減薯蕷丸干預(yù)后VD大鼠海馬區(qū)磷酸化Akt(phosphorylated Akt，p-Akt)含量增高，提示加減薯蕷丸可能通過調(diào)節(jié)p-Akt信號通路發(fā)揮抗凋亡作用[9]。而Akt/GSK-3β信號通路是調(diào)控細(xì)胞周期，抗細(xì)胞凋亡的經(jīng)典通路，在神經(jīng)變性疾病中有保護(hù)作用[10]。雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法(2-vessels occlusion method，2-VO)能較好地模擬VD的病理生理過程，是被公認(rèn)的一種復(fù)制大鼠VD模型的理想方法[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期研究，基于Akt/GSK-3β/Cyclin D1信號通路，通過觀察VD模型大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、Akt信號下游GSK-3β及Cyclin D1的表達(dá)探討加減薯蕷丸防治VD的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g，購自湖北省疾病控制中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號為SCXK(鄂)2017-0002]，大鼠購買后于自然光線下飼養(yǎng)1周，室溫控制在(23±2)℃，自由進(jìn)食、進(jìn)水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 藥材來源于湖北省中醫(yī)院中藥房，由湖北省中醫(yī)院制劑中心制備成院內(nèi)制劑(薯蕷健脾益智合劑，批準(zhǔn)文號為鄂藥制字Z20150027)，將山藥、熟地黃、何首烏、黨參、白芍、全當(dāng)歸、炙遠(yuǎn)志等14味中藥材經(jīng)物理方法濃縮提純?yōu)榭诜?，每毫升含原生藥? g，每瓶250 mL，置于4 ℃冰箱中儲藏備用。尼莫地平片(每片20 mg，批準(zhǔn)文號為H10910040，由天津市中央藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，用時(shí)搗碎，溶于水中制成2.5 mg/mL混懸液。

1.3 主要試劑 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色所需試劑：由湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；正常兔血清(AR1010)、兔抗GSK-3β、鼠抗β-actin(BM0627)、熒光Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG(BA1032)：Boster公司；1∶100一抗(Cyclin D1,GB13044)：Abcam公司；1∶100二抗(K5007)、免疫組織化學(xué)試劑盒DAB顯色劑(K5007)：DAKO公司。

1.4 主要儀器 脫水機(jī)、包埋機(jī)：武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(jī)：上海徠卡儀器有限公司；垂直電泳槽：北京六一儀器廠；BX53型生物顯微鏡：日本奧林巴斯公司。

2 方法

2.1 VD模型復(fù)制 取30只大鼠，采用改良2-VO法永久性阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈復(fù)制VD大鼠模型。術(shù)前大鼠禁食8～12 h，禁水4 h，取仰臥位固定，異氟烷吸入麻醉，手術(shù)刀沿頸部正中偏右切開皮膚，逐層分離暴露出右側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎并剪斷，以青霉素防止感染，逐層縫合。1周后用同種方法阻斷左側(cè)頸總動(dòng)脈。術(shù)中大鼠一般情況良好，術(shù)后放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)觀察,另10只大鼠設(shè)為正常組。

2.2 干預(yù)方法 30只被復(fù)制模型的大鼠均于手術(shù)后0.5 h內(nèi)清醒，給予自由飲用少量生理鹽水補(bǔ)充體液。1周后稱體質(zhì)量、標(biāo)記編號，隨機(jī)分為模型組、中藥組、西藥組，中藥組予加減薯蕷丸、西藥組予尼莫地平、正常組和模型組予生理鹽水灌胃，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體之間用藥劑量的換算系數(shù)[12]計(jì)算大鼠的實(shí)驗(yàn)用藥劑量，每只大鼠按10 mL/kg劑量灌胃，每日1次。

2.3 標(biāo)本采集 4組大鼠于灌胃后6周摘取海馬：異氟烷吸入麻醉，打開胸腔，左心室注射生理鹽水50 mL，同時(shí)剪開右心耳，至放出澄清液體，開顱，冰上迅速剝離海馬，4%多聚甲醛固定24 h后，沿矢狀位切成20 μm的組織切片，在30%蔗糖溶液中脫水12 h,-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，用于HE染色觀察，GSK-3β、CyclinD1檢測。

2.4 檢測方法

2.4.1 海馬神經(jīng)細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)觀察 HE染色，無水乙醇脫水，二甲苯樹膠封固，200倍光鏡下觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化。正常細(xì)胞核無水腫及細(xì)胞皺縮，呈圓形或橢圓形，變性神經(jīng)細(xì)胞核水腫、皺縮，核質(zhì)深染，輪廓邊界模糊。

2.4.2 Western blot法檢測GSK-3β表達(dá)水平 取備用標(biāo)本，用蛋白裂解液和酶抑制劑提取組織總蛋白，BCA定量后取40 μg蛋白上樣，在10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，電泳轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5% BSA封閉2 h，經(jīng)一抗GSK-3β(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗IgG(1∶3 000)室溫孵育2 h，漂洗3次后用ECL顯色。內(nèi)參照β-actin用同樣方法檢測。以GSK-3β/β-actin的比值表示GSK-3β蛋白的相對表達(dá)水平。

2.4.3 免疫熒光染色檢測海馬組織Cyclin D1的表達(dá)水平 取備用標(biāo)本，37 ℃下，用0.01 mmol/L枸櫞酸鹽液微波修復(fù)30 min。滴加一抗Cyclin D1(1∶100稀釋)，4 ℃過夜；PBST液沖洗切片3次，每次3 min，擦干后滴加熒光Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶100稀釋)，37 ℃濕盒避光孵育1 h，PBST清洗切片3次，每次5 min，保持濕度封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖片，陽性細(xì)胞呈紅色熒光亮點(diǎn)。每張切片選取3張400倍免疫熒光照片，用IPP 6.0軟件進(jìn)行光密度分析，計(jì)算平均光密度(optical density, OD)。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠海馬的組織形態(tài)學(xué)變化 正常組神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，染色均勻，結(jié)構(gòu)層次完整，分界清晰。模型組大部分神經(jīng)細(xì)胞稀疏，細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)缺失變性，細(xì)胞排列紊亂、層次不清，可見胞核變形皺縮，胞質(zhì)區(qū)域深染，胞體腫脹。與模型組比較，中藥組、西藥組海馬神經(jīng)細(xì)胞上述病理改變明顯減輕，細(xì)胞結(jié)構(gòu)輕度缺失，細(xì)胞排列基本規(guī)則，部分細(xì)胞核深染、皺縮，形態(tài)接近正常組。見圖1。

注：A.正常組；B.模型組；C.西藥組；D.中藥組

圖1各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，10×20倍)

3.2 各組大鼠海馬區(qū)GSK-3β、Cyclin D1表達(dá)水平比較 與正常組相比，模型組GSK-3β表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)，Cyclin D1表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，中藥組和西藥組GSK-3β表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Cyclin D1表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)；中藥組與西藥組GSK-3β、CyclinD1表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、圖3、圖4。

注：A.正常組；B.模型組；C.西藥組；D.中藥組

注:A.正常組;B.模型組;C.西藥組;D.中藥組圖3 各組大鼠海馬區(qū)Cyclin D1表達(dá)水平(免疫熒光染色,10×40倍)

圖4 各組大鼠海馬GSK-3β、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平比較(n=5)

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，VD大鼠模型組海馬區(qū)大部分神經(jīng)細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)缺失變性、細(xì)胞稀疏，加減薯蕷丸、尼莫地平干預(yù)后VD大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞病理改變明顯減輕，結(jié)果提示加減薯蕷丸對VD大鼠模型海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用。GSK-3β參與多條控制細(xì)胞凋亡的傳導(dǎo)路徑，如Wnt、PI3K-Akt、cAMP-PKA、Aβ、PTEN；它可通過抑制腦缺血區(qū)HSF-1、CREB、Bcl-2等促存活轉(zhuǎn)錄因子，激活Bax、caspase-3、JNK、p53等促凋亡轉(zhuǎn)錄因子基因而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。真核細(xì)胞有絲分裂、增殖的過程稱細(xì)胞周期，共分為4期，即G1期、S期、G2期、M期，Cyclin D1是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換的至關(guān)重要的調(diào)節(jié)蛋白，負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞增殖，是細(xì)胞周期的啟動(dòng)因子[5-6]。有研究表明，腦缺血后不同時(shí)間點(diǎn)GSK-3β蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡數(shù)量成正相關(guān)[13]。本研究中，VD模型組GSK-3β蛋白表達(dá)水平較正常組明顯升高(P<0.05)，中藥組、西藥組海馬區(qū)GSK-3β表達(dá)水平較模型組明顯降低(P<0.05)，且兩組GSK-3β表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明加減薯蕷丸可下調(diào)促凋亡蛋白GSK-3β的表達(dá)。Cyclin D1是GSK-3β的下游分子，GSK-3β失活后其表達(dá)水平上調(diào)[14]。本研究中，各組均可見陽性表達(dá)的Cyclin D1(細(xì)胞呈紅色熒光亮點(diǎn))，模型組Cyclin D1表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；中藥組、西藥組Cyclin D1表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，且兩組Cyclin D1表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果提示GSK-3β與Cyclin D1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，加減薯蕷丸干預(yù)后VD大鼠海馬區(qū)p-Akt含量增高，提示加減薯蕷丸可能通過調(diào)節(jié)p-Akt信號通路發(fā)揮抗凋亡作用[7]。筆者認(rèn)為可以結(jié)合前期研究，從Akt-GSK3β-Cyclin D1信號通路探討其抗海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。Akt作為PI3K/Akt/GSK-3β信號傳導(dǎo)通路的一部分，其蘇氨酸Thr308位點(diǎn)及絲氨酸Ser473位點(diǎn)經(jīng)PDK-1使p-Akt磷酸化。p-Akt是一種有活性的激酶，可磷酸化其下游主要靶激酶之一的GSK-3β的Ser9位點(diǎn)，使GSK-3β失活，GSK-3β介導(dǎo)的氨基酸殘基threonine286的磷酸化則可使細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1失去活性[15-17]。GSK-3β失活后其表達(dá)水平上調(diào)。本研究中，加減薯蕷丸可下調(diào)GSK-3β的表達(dá)，GSK-3β與Cyclin D1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示腦缺血后，Akt/GSK3β/Cyclin D1信號通路被啟動(dòng)，p-Akt大量表達(dá)能促進(jìn)GSK3β蛋白失活，上調(diào)Cyclin D1的表達(dá)而保護(hù)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，加減薯蕷丸減少VD大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是激活A(yù)kt，使GSK3β磷酸化而失活，從而上調(diào)CyclinD1表達(dá)。本研究中，模型組Cyclin D1也有少量表達(dá)，可能是腦缺血后機(jī)體啟動(dòng)自身保護(hù)機(jī)制的結(jié)果。另有研究發(fā)現(xiàn)，局灶性缺血再灌注后Cyclin D1的過量表達(dá)可誘發(fā)缺血神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[18]，其研究對象、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、Cyclin D1檢測時(shí)間與本實(shí)驗(yàn)不同。

VD屬中醫(yī)學(xué)“呆病”范疇，髓減腦消、神機(jī)失用為其病機(jī)。加減薯蕷丸中山藥、黨參、白術(shù)、茯苓益氣健脾利濕；何首烏、熟地黃、當(dāng)歸補(bǔ)血填精、益腎充髓，這是以“有形之血生于無形之氣”的理論，承“薯蕷丸”大補(bǔ)后天之意；石菖蒲、遠(yuǎn)志、酸棗仁安神定志、開竅益智；五味子酸收固精；基于呆病病機(jī)、“精髓血互生”理論，減去原方桂枝、防風(fēng)、桔梗等祛風(fēng)散結(jié)藥，達(dá)“脾腎同調(diào)、標(biāo)本兼顧”之效。研究顯示，加減薯蕷丸可提高D-半乳糖致衰老大鼠模型紅細(xì)胞SOD活性，減少腦脂褐素生成，抑制腦MAO-B活性，發(fā)揮延緩衰老作用[19]；可提高海馬區(qū)NGF、NT-3的含量，改善認(rèn)知功能[20]。尼莫地平是1，4-二氫吡啶類鈣離子拮抗劑，能改善腦供血和腦代謝，增強(qiáng)衰老動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性，臨床上可用于治療VD[21]。本實(shí)驗(yàn)中尼莫地平組與中藥組VD大鼠海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)接近，GSK-3β、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示加減薯蕷丸能有效地治療VD。

本次實(shí)驗(yàn)初步得出加減薯蕷丸可能通過Akt/GSK-3β/Cyclin D1信號通路，激活A(yù)kt，使GSK-3β蛋白失活而上調(diào)Cyclin D1表達(dá)，以抵抗腦缺血后海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，但VD神經(jīng)細(xì)胞凋亡涉及許多信號通路及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，機(jī)制復(fù)雜，加減薯蕷丸對VD的干預(yù)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。