譚暢 曹靖瀅 馮穎 杜姍姍

摘要：采用大孔樹(shù)脂對(duì)紫薯結(jié)合酚粗提液進(jìn)行純化，研究各因素對(duì)純化效果的影響，并確定純化工藝參數(shù)。結(jié)果表明：HPD-100大孔樹(shù)脂適于純化紫薯結(jié)合酚，當(dāng)上樣液濃度為0.25 mg/mL、上樣液pH值為3.0、上樣體積為3.6 BV時(shí)，HPD-100大孔樹(shù)脂對(duì)紫薯結(jié)合酚的吸附率可達(dá)78.08%±0.04%；以pH值5.0、體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇水溶液為解吸劑，解吸體積為6.8 BV，解吸率可達(dá)81.45%±0.34%。

關(guān)鍵詞：紫薯；結(jié)合酚；大孔樹(shù)脂；純化；吸附；解吸

中圖分類號(hào)：TS215 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-1161（2018）04-0039-04

植物多酚為植物體內(nèi)復(fù)雜的酚類次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、防治心血管疾病等廣泛的藥理活性。隨著人們健康意識(shí)的增強(qiáng)，植物多酚逐漸成為食品科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。根據(jù)存在形式，植物多酚可分為游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種，游離酚是游離于細(xì)胞質(zhì)中的多酚，具有良好的溶解性，易溶于水或有機(jī)溶劑；而結(jié)合酚與細(xì)胞壁中纖維素、果膠、蛋白等結(jié)合，不能直接用溶劑萃取得到，需經(jīng)過(guò)酶解或強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液釋放后才能得到，因此常被忽略。然而這些結(jié)合酚卻是食物中具有生物活性的有益成分，朱春秋等人的研究表明結(jié)合酚可被大鼠通過(guò)消化道吸收，且具有良好的體內(nèi)抗氧化能力；Jung等人發(fā)現(xiàn)結(jié)合酚可以在結(jié)腸中釋放并產(chǎn)生一定的生物活性，有益于人體健康。相對(duì)于游離酚，結(jié)合酚經(jīng)腸道微生物菌群發(fā)酵作用后能發(fā)揮更強(qiáng)的生物活性。由于結(jié)合酚具有這些良好的生物活性，近年來(lái)人們開(kāi)始關(guān)注結(jié)合酚，目前在應(yīng)用酸水解法、堿水解法釋放結(jié)合酚的工藝參數(shù)優(yōu)化方面進(jìn)行了較多的研究。對(duì)釋放出來(lái)的結(jié)合酚，通常采用乙酸乙酯萃取的方法進(jìn)行純化，該方法消耗大量有機(jī)溶劑、成本高、結(jié)合酚得率低。大孔吸附樹(shù)脂可以通過(guò)良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，有選擇性地物理吸附水溶液中的有機(jī)物，有效去除淀粉、還原糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，工藝簡(jiǎn)單、操作方便、成本低廉，廣泛應(yīng)用于游離酚的純化，如Lisha Xi等人采用AB-8大孔樹(shù)脂純化了甘薯葉游離多酚；但在應(yīng)用大孔樹(shù)脂純化結(jié)合酚方面的研究缺乏。本課題將大孔樹(shù)脂應(yīng)用于紫薯結(jié)合酚的純化，以期為紫薯結(jié)合酚的制備及進(jìn)一步活性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用甘薯：品種“遼薯20”，由遼寧省農(nóng)科院提供。

大孔樹(shù)脂HPD-100，HPD-400，HPD-600，HPD-700，D101，AB-8，ADS-7，S-8，D-4020，NKA-9：滄州寶恩化工有限公司；無(wú)水乙醇、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉、三氯化鐵、鐵氰化鉀、鹽酸、氯化鉀、醋酸、醋酸鈉、福林酚試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：上海舜宇恒科學(xué)儀器有限公司；TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器責(zé)任有限公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋；DHG-9070A型恒溫干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；pH計(jì)：上海榮漢自動(dòng)化儀表有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HL-2型數(shù)顯恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司；HZQ-F型全溫振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；CR21G型冷凍離心機(jī)：日立有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫薯結(jié)合酚粗提液（上樣液）的制備 取50 g紫薯凍干粉，以料液比1∶10的比例加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇水溶液，于50 ℃水浴中放置2 h提取游離酚，

10 000 r/min離心20 min，棄去上清液，保留濾渣；按上述步驟重復(fù)提取2次，至游離酚提取完全，將濾渣真空干燥至質(zhì)量恒定。取充分提取游離酚后的干燥濾渣，以料液比1∶10加入2 mol/L的NaOH溶液，于室溫下用磁力攪拌器水解5 h以釋放結(jié)合酚，水解結(jié)束后以10 000 r/min離心20 min，棄去濾渣，收集上清液即為結(jié)合酚粗提液。

1.3.2 大孔樹(shù)脂的預(yù)處理 將大孔樹(shù)脂以無(wú)水乙醇浸泡24 h后，用蒸餾水沖洗至樹(shù)脂無(wú)乙醇?xì)馕稙橹?，然后浸泡在蒸餾水中備用，以防樹(shù)脂干燥結(jié)塊。

1.3.3 大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附解吸 1） 靜態(tài)吸附。稱取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的大孔樹(shù)脂1.0 g置于錐形瓶中，分別加入濃度為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL和pH值為1.0，3.0，5.0，7.0，9.0，11.0的紫薯結(jié)合酚粗提液40 mL，密封后于室溫下在振蕩培養(yǎng)箱中振蕩吸附12 h（100 r/min），抽濾，測(cè)定濾液中結(jié)合酚濃度，計(jì)算吸附率，依次考察上樣液濃度和pH值對(duì)樹(shù)脂吸附效果的影響。2） 靜態(tài)解吸。將過(guò)濾后的樹(shù)脂置于錐形瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為10%，30%，50%，70%，90%和pH值為1.0，3.0，5.0，7.0，9.0，11.0的乙醇水溶液40 mL，密封后于室溫下在振蕩培養(yǎng)箱中振蕩解吸12 h（100 r/min），抽濾，測(cè)定濾液中結(jié)合酚濃度，計(jì)算解吸率，依次考察乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH值對(duì)樹(shù)脂解吸效果的影響。

1.3.4 大孔樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附解吸 1） 動(dòng)態(tài)吸附。稱取樹(shù)脂20 g，裝柱（Φ1.5 cm×40.0 cm），用pH值3.0、濃度0.25 mg/mL的結(jié)合酚上樣液上樣，進(jìn)行吸附，每10.0 mL收集一次流出液，測(cè)定其吸光度，計(jì)算吸附率，考察上樣體積對(duì)樹(shù)脂吸附效果的影響。2） 動(dòng)態(tài)解吸。以pH值5.0、流速1.0 mL/min、體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇水溶液解吸，每10.0 mL收集一次流出液，測(cè)定其吸光度，計(jì)算解吸率，考察解吸劑體積對(duì)樹(shù)脂解吸效果的影響。

1.3.5 樹(shù)脂吸附率和解吸率的計(jì)算

1） 吸附率的計(jì)算公式為：

A=×100%

式中：A為吸附率，%；C0為起始濃度，mg/mL；C1為平衡濃度，mg/mL。

2） 解吸率的計(jì)算公式為：

D=×100%

式中：D為解吸率，%；C2為解吸后溶液中總酚濃度，mg/mL；V1為吸附溶液體積，mL；V2為解吸溶液體積，mL。

1.3.6 結(jié)合酚含量的測(cè)定 1） 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。參考Mary的方法，精確稱取沒(méi)食子酸0.1 g，用蒸餾水配制成濃度為1.0 mg/mL的溶液，分別吸取該溶液0，0.3，0.5，1.0，1.2，1.5 mL于10.0 mL刻度試管中，用蒸餾水定容，搖勻。然后從各濃度溶液中吸取0.5 mL加入到10.0 mL離心管中，分別用蒸餾水定容到5.0 mL，再加入0.5 mL福林酚試劑，搖勻，加入0.5 mol/L的碳酸鈉溶液1.0 mL，搖勻。放置1 h，以空白來(lái)調(diào)零，于725 nm下測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3次。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=4.927 0 x-0.021 2，R2=0.999 2。式中：y為待測(cè)樣品在725 nm處的吸光度；x為待測(cè)樣中多酚的質(zhì)量濃度，mg/mL。2） 樣品測(cè)定。取樣液0.5 mL，參照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其結(jié)合酚的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂的篩選

選取10種大孔樹(shù)脂AB-8，HPD-100，HPD-400，HPD-600，HPD-700，D101，ADS-7，S-8，D4020，NKA-9，

進(jìn)行靜態(tài)吸附和解吸，選取對(duì)紫薯結(jié)合酚吸附和解吸效果好的大孔樹(shù)脂進(jìn)一步優(yōu)化工藝參數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知：大孔樹(shù)脂S-8對(duì)紫薯結(jié)合酚的吸附率最高；ADS-7，HPD-100，D101，HPD-400次之，四者之間無(wú)顯著性差異。NKA-9，D-4020對(duì)紫薯結(jié)合酚的解吸率最高；HPD-100，HPD-700，HPD-400，AB-8次之，四者之間無(wú)顯著性差異。綜合吸附率和解吸率，選擇HPD-100對(duì)紫薯結(jié)合酚進(jìn)行純化。

2.2 上樣液濃度對(duì)樹(shù)脂吸附結(jié)合酚效果的影響

不同上樣液濃度下樹(shù)脂吸附結(jié)合酚的效果如圖1所示。

由圖1可以看出：隨著上樣液中結(jié)合酚濃度增大，樹(shù)脂對(duì)結(jié)合酚的吸附率呈顯著的升高趨勢(shì)?？紤]到結(jié)合酚濃縮需要消耗較多熱能，且加熱過(guò)程中會(huì)造成結(jié)合酚的損失，選擇0.25 mg/mL作為結(jié)合酚最佳的上樣液濃度。

2.3 上樣液pH值對(duì)樹(shù)脂吸附結(jié)合酚效果的影響

不同上樣液pH值下樹(shù)脂吸附結(jié)合酚的效果如圖2所示。

由圖2可以看出：樹(shù)脂對(duì)紫薯結(jié)合酚的吸附率在酸性環(huán)境條件下明顯高于中性和堿性環(huán)境，這可能是因?yàn)榉宇愇镔|(zhì)在酸性條件下更為穩(wěn)定。在pH值為1.0和3.0條件下，樹(shù)脂對(duì)紫薯結(jié)合酚的吸附率無(wú)顯著性差異，從節(jié)省調(diào)整pH值所消耗試劑的角度考慮，選擇上樣液的pH值為3.0。

2.4 上樣體積對(duì)樹(shù)脂吸附結(jié)合酚效果的影響

不同上樣體積下樹(shù)脂吸附結(jié)合酚的效果如圖3所示。

由圖3可以看出：隨著上樣體積增加，樹(shù)脂對(duì)結(jié)合酚的吸附率逐漸降低，當(dāng)上樣體積為90 mL時(shí)，吸附率已經(jīng)降低到75%以下。選擇上樣體積為80 mL，即3.6 BV。

2.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)樹(shù)脂解吸結(jié)合酚效果的影響

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下樹(shù)脂解吸結(jié)合酚的效果如圖4所示。

由圖4可以看出：隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，樹(shù)脂對(duì)結(jié)合酚的解吸率逐漸升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)達(dá)到最大；乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，溶劑極性減小，導(dǎo)致對(duì)結(jié)合酚的解吸效果下降。因此，選擇結(jié)合酚的解吸劑濃度為50%。

2.6 解吸劑pH值對(duì)樹(shù)脂解吸結(jié)合酚效果的影響

不同解吸劑pH值下樹(shù)脂解吸結(jié)合酚的效果如圖5所示。

由圖5可以看出：中性條件下樹(shù)脂對(duì)結(jié)合酚的解吸率最低；在酸性條件和堿性條件下，pH值越大，解吸率越高。這可能是由于弱酸性條件下多酚類物質(zhì)為分子形態(tài)，有利于其解吸；堿性條件下多酚類物質(zhì)會(huì)帶負(fù)電荷，與大孔樹(shù)脂的結(jié)合力降低，也有利于解吸。酚類物質(zhì)在酸性條件下比堿性條件更穩(wěn)定，因此選擇解吸劑pH值為5.0。

2.7 解吸劑體積對(duì)樹(shù)脂解吸結(jié)合酚效果的影響

不同解吸劑體積下樹(shù)脂解吸結(jié)合酚的效果如圖6所示。

由圖6可以看出：用pH值5.0的50%乙醇水溶液以1.0 mL/min的速度對(duì)紫薯結(jié)合酚進(jìn)行解吸，當(dāng)解吸液體積達(dá)到150 mL（即6.8 BV）以后，解吸率呈平緩升高趨勢(shì)。因此，選擇解吸體積為150 mL，此時(shí)解吸率達(dá)到81.45%±0.34%。

3 結(jié)論

HPD-100大孔樹(shù)脂適于對(duì)紫薯結(jié)合酚進(jìn)行純化。吸附條件為：上樣液濃度0.25 mg/mL、上樣液pH值3.0、上樣體積80 mL（即3.6 BV），吸附率達(dá)到78.08%±0.04%；解吸條件為：解吸劑用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇水溶液（pH值5.0）、解吸體積150 mL（即6.8 BV），解吸率達(dá)到81.45%±0.34%。

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