陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046

幽門螺旋桿菌相關(guān)性胃炎是指與幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染相關(guān)的胃黏膜急慢性炎癥或萎縮性病變[1]。Hp感染后可激發(fā)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激(reactive oxygen species，ROS)反應(yīng)，生成的一氧化氮(Nitric Oxide，NO)、超氧化物(Superoxide，O2-)等產(chǎn)物是造成胃黏膜損傷，導(dǎo)致胃炎發(fā)生的重要因素[2-3]。NO是由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸生成的，其中由iNOS活化后產(chǎn)生的過量NO發(fā)揮有害效應(yīng)。因此iNOS表達(dá)量是NO異常產(chǎn)生的關(guān)鍵[4]。ERK是促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中成員之一。它磷酸化后激活，激活的ERK1/2介導(dǎo)多種生物學(xué)反應(yīng)[5-6]。大量研究證明，ROS是導(dǎo)致ERK1/2磷酸化的重要激活劑[7]，而ERK1/2激活后又加劇了ROS對(duì)胃黏膜的損傷，抑制了胃黏膜的修復(fù)，引起急慢性胃炎，甚至出現(xiàn)細(xì)胞的過度增值分化[8]。蒲公英作為傳統(tǒng)的中草藥具有廣泛的藥理活性[9]，研究表明，蒲公英甾醇具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤等藥理作用[10]。本實(shí)驗(yàn)中蒲公英甾醇通過ROS/ERK/iNOS途徑減輕HP相關(guān)性胃炎大鼠胃黏膜的氧化損傷，保護(hù)胃黏膜。為中草藥蒲公英資源的有效開發(fā)和合理應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物 成年雄性清潔級(jí)SD大鼠(220-240g)48只，購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCXK (陜) 2012-003。實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)溫度(20±2)℃，所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥品與試劑 快速尿素酶試驗(yàn)試劑盒(安信生物技術(shù)有限公司)，蒲公英甾醇純度≥98%(成都瑞芬思生物科技有限公司)，抗體：iNOS (sc-5302)、NOX2 (sc-20782)、ph-ERK1/2(sc-16982)、NOX4 (sc-21860)、SOD (sc-17767)。

1.3 儀器 DXM1200F光學(xué)顯微鏡(尼康)，TS100倒置顯微鏡(尼康)，KD2800低溫恒冷切片機(jī)，GENIUS 16K臺(tái)式高速離心機(jī)，TP1020脫水機(jī)，ZMN200烘片機(jī)，5010 型石蠟切片染色機(jī)，微波爐，高壓鍋，恒溫水浴箱，WB機(jī)(Bio-Rad, USA)。

2 方法

2.1 造模 48只大鼠隨機(jī)分成正常組、正常+蒲公英甾醇組、模型組、模型+蒲公英甾醇組，每組各12只。參考文獻(xiàn)[11]對(duì)模型組及模型+蒲公英甾醇組大鼠進(jìn)行造模。造模大鼠禁食12 h后用NaHCO3+消炎痛溶液0.5 mL/只進(jìn)行灌胃，然后禁食6 h，以HP菌液(含量109/mL)1.5 mL/只灌胃，再禁食、禁水4 h，隔天1次,連續(xù)10 d，正常組及正常+蒲公英甾醇組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)。4周后，每組隨機(jī)處死2只大鼠，取出鼠胃并沿胃大彎剪開,取一半胃黏膜組織做快速尿素酶實(shí)驗(yàn)、黏膜涂片革蘭染色，以判斷胃竇黏膜HP定植情況；取另一半胃黏膜組織,用4%多聚甲醛固定24 h后進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。造模組大鼠胃竇黏膜變薄，有中度慢性活動(dòng)性炎癥和中度萎縮，上皮糜爛，固有層充血，中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等不同程度炎性改變，正常組的大鼠胃黏膜切片未見胃炎的病理改變。

2.2 給藥 正常+蒲公英甾醇組與模型+蒲公英甾醇組大鼠按10 mg/kg·d蒲公英甾醇，正常組和模型組用等體積生理鹽水于每天上午9～10時(shí)灌胃，連續(xù)給藥4周。

2.3 Western Blot檢測(cè) 取胃組織勻漿后測(cè)定蛋白含量，制備SDS-PAGE膠，蛋白變性、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉加一抗過夜，TBST洗膜，二抗封閉，TBST洗膜，發(fā)光。分別測(cè)定ph-ERK1/2、iNOS、NOX2、NOX4、SOD蛋白的含量。以β-actin作為內(nèi)參，使用Image J分析軟件，計(jì)算每一樣本蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)Hp相關(guān)性胃炎大鼠胃黏膜的NOX2含量的影響 由表1、圖1可知，模型組大鼠NOX2的含量明顯高于正常組及正常+蒲公英甾醇組大鼠(P<0.05)；模型+蒲公英甾醇組的NOX2含量明顯低于模型組(P<0.05)，而與正常組及正常+蒲公英甾醇組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠胃黏膜NOX2、NOX4、iNOS、SOD、t-ERK、ph-ERK蛋白的表達(dá) (%,±s)

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3.2 對(duì)Hp相關(guān)性胃炎大鼠胃黏膜的NOX4含量的影響 由表1、圖2可知，模型組大鼠NOX4的含量明顯高于正常組及正常+蒲公英甾醇組大鼠(P<0.05)；模型+蒲公英甾醇組NOX4含量明顯低于模型組(P<0.05)，而與正常組及正常+蒲公英甾醇組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.3 對(duì)Hp相關(guān)性胃炎大鼠胃黏膜iNOS含量的影響 由表1、圖3可知，模型組大鼠iNOS的含量明顯高于正常組及正常+蒲公英甾醇組大鼠(P<0.05)；模型+蒲公英甾醇組的iNOS含量明顯低于模型組(P<0.05)，而與正常組及正常+蒲公英甾醇組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

3.4 對(duì)Hp相關(guān)性胃炎大鼠胃黏膜SOD含量的影響 由表1、圖4可知，模型組大鼠SOD的含量明顯低于正常組及正常+蒲公英甾醇組大鼠(P<0.05)；模型+蒲公英甾醇組的SOD含量明顯高于模型組(P<0.05)，而與正常組及正常+蒲公英甾醇組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.5 對(duì)Hp相關(guān)性胃炎大鼠胃黏膜的ph-ERK1/2、t-ERK1/2含量的影響 由表1、圖5可知，模型組大鼠ph-ERK1/2的含量明顯高于正常組及正常+蒲公英甾醇組大鼠(P<0.05)；模型+蒲公英甾醇組的ph-ERK1/2含量明顯低于模型組(P<0.05)，而與正常組及正常+蒲公英甾醇組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，各組間t-ERK1/2的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

4 討論

幽門螺旋桿菌(Hp)是最常見的傳染性病原菌之一，全球有超過50%的人群感染,我國的平均感染率高達(dá)56%[12]。研究表明，在Hp引起的胃黏膜損傷中，氧化應(yīng)激起了十分重要的作用，首先，氧自由基可形成大量的脂質(zhì)過氧化物，損傷細(xì)胞內(nèi)線粒體和溶酶體，引起胃黏膜血流障礙，導(dǎo)致黏膜損傷。其次，氧自由基也可破壞上皮間質(zhì)透明質(zhì)酸酶和膠原纖維網(wǎng)而引起胃黏膜的進(jìn)一步損害[8]。NADPH氧化酶是消化道黏膜ROS的重要來源，它的激活是組織內(nèi)活性氧簇產(chǎn)生的重要原因之一，NADPH氧化酶(NOX)家族有7個(gè)成員(NOX1，NOX2，NOX3，NOX4，NOX5，DUOX1，DUOX2)，在消化道中存在的NOX家族成員主要是NOX2和NOX4。它們是消化系統(tǒng)疾病中ROS產(chǎn)生的主要來源[13]。當(dāng)Hp進(jìn)入機(jī)體后被中性粒細(xì)胞迅速吞噬，形成吞噬體，通過NAD(P)H氧化酶系統(tǒng)，增加過氧化物、一氧化氮等產(chǎn)物的產(chǎn)生，致使胃黏膜受損。而超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是生物體內(nèi)氧自由基清除的首要防線，它可降低氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞膜的損害并且能夠修復(fù)受損的細(xì)胞，起到保護(hù)胃黏膜的作用[14]。

iNOS是誘導(dǎo)型一氧化合酶(NOS)，可在內(nèi)毒素、脂多糖、ROS等多種外界因素的刺激下被激活，生成大量的NO，而高濃度的NO對(duì)胃黏膜細(xì)胞有毒性作用，引起胃黏膜的損傷[4]。ERK是將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部的重要物質(zhì)，已有研究證明，ERK通路活性增高不僅可促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞的增殖，而且該通路的激活對(duì)于胃黏膜的損傷也具有重要意義[7]。Hp定植胃黏膜后，胃黏膜ROS明顯增加，引發(fā)胃黏膜血流障礙，導(dǎo)致胃黏膜損傷。同時(shí)ERK通路被激活，從而使細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)多種核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，調(diào)控基因表達(dá)，加劇胃黏膜的損傷，抑制胃黏膜的修復(fù)，引起急慢性胃炎，甚至出現(xiàn)細(xì)胞的過度增值分化。

目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)Hp感染的標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法面臨著Hp對(duì)抗生素的耐藥問題,而耐藥性是導(dǎo)致Hp根除失敗的主要原因。蒲公英作為傳統(tǒng)的中草藥其主要活性成分蒲公英甾醇被證明具有抗氧化、抗炎的重要藥理作用，而被臨床上廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，蒲公英甾醇能夠明顯減少Hp相關(guān)性胃炎大鼠胃黏膜的NOX2、NOX4、iNOS和ph-ERK1/2的表達(dá)，增加SOD的表達(dá)，因此我們認(rèn)為蒲公英甾醇可通過ROS/ERK/iNOS途徑減輕Hp相關(guān)性胃炎大鼠胃黏膜的氧化損傷，保護(hù)胃黏膜。這為其作為該疾病的防治藥物提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。