焦欣田，薛衛(wèi)杰，趙艷玲，張長波，閆 雷，劉仲齊*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150030；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所農(nóng)業(yè)環(huán)境污染修復研究中心，天津300191）

重金屬鎘（Cd）因其污染性強、污染范圍廣而受到廣泛關注。Cd在植物體內積累到一定程度后會抑制光合作用和呼吸作用，甚至導致生物量下降或死亡[1]。水稻是Cd積累能力最強的糧食作物，土壤中的Cd可以通過根系吸收轉運到葉片和穗軸中，大氣沉降中的Cd也可以通過葉片進入植物體內，在籽粒灌漿期間轉運到稻米中[2-3]。稻米中的Cd通過食物鏈進入人體，危害人體健康[4]。

鋅（Zn）是許多蛋白質和酶的重要組成部分，對植物的生長發(fā)育起著至關重要的作用[5-6]。研究表明，Zn與Cd會競爭相同載體蛋白進行跨膜運輸[7]。加Zn可使水稻、煙草、小麥對Cd的吸收減弱，說明Zn對植物吸收Cd可能存在拮抗作用[8]。施Zn能促進小麥的光合作用，使POD酶活性提高，質膜穩(wěn)定性增強，還降低了小麥體內脯氨酸的含量，進而加強了小麥對Cd脅迫的抵御能力[9]。此外，Zn可以通過緩解DNA損傷、調控脯氨酸及多胺代謝來降低Cd對植物的毒害[10]。土壤中Zn和Cd之間也存在交互作用。土壤中添加Cd會使Zn的吸附量下降、吸附速率減慢[11]。Zn能與吸附在土壤膠體上的Zn進行離子交換，降低土壤中Zn的有效性，增加土壤中可溶性Zn的含量。隨著土壤中Zn濃度的增加，Zn與Cd在配合物上發(fā)生顯著的競爭吸附，使得土壤中有效態(tài)Cd顯著增加[12]。

硅（Si）是土壤中第二大元素，植物可以在莖葉中積累豐富的Si。Si能提高植物生長發(fā)育過程中抵抗各種生物和非生物脅迫的能力[13]。水稻是一種高積累Si的植物[14]。Si在質外體與Cd形成沉淀是緩解植物體內重金屬毒害的主要原因[15]。Si和Cd在一些代謝不活躍的組織尤其是中柱鞘、木質部和韌皮部細胞壁內皮層形成的Si-Cd沉淀也可以抑制Cd的吸收和轉運[16]。Si還能將更多的Cd分隔在液泡中或固定在節(jié)間[17-18]，從而減少Cd在水稻中的移動。這些結果表明，施加Si能通過影響Cd在植物體內的吸收轉運來減緩Cd的毒害作用。

雖然一定濃度的Si和Zn都能抑制水稻對Cd的吸收轉運，但未見Si-Zn互作方式與水稻Cd吸收轉運關系的研究報道。本文以水稻幼苗為材料，通過在根際環(huán)境中施加不同濃度的巰基硅和Zn，對水稻幼苗Cd的亞細胞分布特征、必需元素、可溶性蛋白進行研究，探討了根際環(huán)境中添加Si和Zn離子抑制水稻Cd吸收轉運的互作機理，從而為降Cd復合肥料的研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

以湘早秈24（X24）為供試材料，選用飽滿均一的水稻種子，在300 mL 5%的NaClO中浸泡30 min，用去離子水反復沖洗以去除殘余的NaClO。水稻種子沖洗干凈后均勻放入裝有少量水的育苗盤內，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)72 h后移入人工氣候室。待水稻長到兩葉一心時，選取均一的水稻幼苗移到裝有8 L 1/10Hoagland營養(yǎng)液的塑料盆（35 cm×25 cm×12 cm）中進行培養(yǎng)。塑料盆上蓋有帶小圓孔的硬塑料板，將幼苗用海綿固定在小圓孔內。待水稻長到三葉一心時挑選長勢一致的幼苗，在去離子水中饑餓1 d，然后放置于以1/10 Hoagland營養(yǎng)液為基礎的不同處理液中處理7 d。水培試驗整個過程在人工氣候室中進行，晝夜時間為16 h/8 h，晝夜溫度為25℃/20 ℃，白天光照為 105 μmol·m-2·s-1、相對濕度為60%[19]。

1.1 培養(yǎng)與處理方法

設置處理液鎘（CdCl2）濃度2.7 μmol·L-1，巰基硅濃度為0.05（Si1）、0.1（Si2）mmol·L-1，Zn濃度（ZnSO4·7H2O）分別為0、0.2 mmol·L-1。巰基硅來自深圳百樂寶生物農(nóng)業(yè)科技有限公司，硅含量≥30%，溶解度為75%，明顯優(yōu)于硅酸鈉（NaSiO3·H2O）的溶解度36.1%。處理液用HCl和NaOH調節(jié)pH至5.5～6。每個處理3次重復。

1.2 樣品采集與處理

將處理好的水稻幼苗根系用5 mmol·L-1的CaCl2浸泡10 min[20]，以吸附去除根系表面的Cd2+，之后用去離子水沖洗干凈，用吸水紙吸干表面水分，用剪刀將地上部與根系分開。一部分放入信封，75℃恒溫烘干，用于全Cd測定；另一部分，分別稱取根系和地上部鮮樣1 g，用錫紙包裹后放入液氮中冷凍，之后置于-80℃儲存，用于亞細胞測定。

1.3 Cd、Si含量的測定

用剪刀將恒重的樣品剪碎，稱重后置于消煮管中，加入7 mL HNO3過夜，用消解儀ED54于110℃加熱2.5 h，冷卻后加入1 mL的H2O2，蓋蓋加熱1.5 h，170℃開蓋趕酸至0.5 mL左右，定容至25 mL，用原子吸收儀（AAS，ZEEnit70d0，Analytikjena，德國）測定樣品中Cd含量[21]。

分別吸取 Si標液 0、0.125、0.25、0.5、1.25、2.5、5 mL 定容至 50 mL，Si含量分別為 0、2.5、5.0、10、25、40、50 μg·mL-1。向10 mL離心管中依次加入2.7 mL去離子水、200 μL Si標液、1.5 mL 0.26 mol·L-1HCl、200 μL 10%鉬酸銨，靜止5 min后再加入200 μL 20%酒石酸、200 μL 2%抗壞血酸搖勻靜止25 min。樣品采用高壓滅菌法處理后依次加入藥品，600 nm處比色[22]。

1.4 亞細胞組分的測定

將冷凍的水稻幼苗放在含有50 mol·L-1Hanks平衡鹽溶液（HEPES）、500 mol·L-1蔗糖溶液、1 mol·L-1二流蘇糖醇（DDT）、5 mmol·L-1抗壞血酸和1%（W/V）聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）的提取緩沖液中勻漿，并用NaOH調pH至7.5。勻漿液通過尼龍布（100目）過濾，用緩沖液沖洗后100 g離心5 min，沉淀為細胞壁組分（F1）。上清液以10 000 g離心30 min，沉淀為細胞器組分（F2），上清液為胞液組分（F3）。所有步驟均在4℃下進行[23]。各組分烘干后按照1.3的步驟測定Cd含量。

圖1 Si、Zn處理對Cd脅迫中根系和地上部Cd及Zn含量的影響Figure1 Effects of Si and Zn treatments on the concentrations of root Cd，shoot Cd，root Zn and shoot Zn under Cd stress

1.5 可溶性蛋白的測定

稱取45.6 g K2HPO4·3H2O和27.2 g KH2PO4放入1 L容量瓶中搖勻，標為A液和B液。將153.8 mL A液和96.2 mL B液加去離子水定容至1 L，配制成pH為7的50 mmol·L-1磷酸緩沖液。將227 mL A液和23 mL B液用去離子水定容至1 L，配制成pH為7.8的0.05 mmol·L-1磷酸緩沖液。稱取0.3 g EDTA-Na2和5 g聚乙烯吡咯-K30溶于1 L pH為7的磷酸緩沖液，配制成粗酶提取液。

將新鮮水稻幼苗用去離子水清洗干凈，然后各稱取0.5 g左右。用液氮研磨，加入8 mL提取液，4℃10 000 r·min-1離心20 min，取上清液待測。

1.6 數(shù)據(jù)處理與計算

元素轉移因子（%）=地上部元素含量/根系元素含量×100%[24]

Cd在水稻根系和地上部亞細胞組分中的分配比率（%）為各器官亞細胞組分中的Cd含量占各器官Cd總量的百分比。

采用Excel 2007、SPSS 11.5進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 Si-Zn互作對水稻幼苗Cd和Zn含量的影響

由圖1所示，施加Si和Zn對水稻根系和地上部Cd含量有顯著影響。施加0.05 mmol·L-1和0.1 mmol·L-1巰基硅可使根系Cd積累量下降5.4%～34.6%（圖1A）。地上部Cd積累量分別下降3.5%和51.8%（圖1B）。同時添加0.2 mmol·L-1Zn和0.05 mmol·L-1Si或0.1 mmol·L-1Si使水稻幼苗根系中的Cd含量分別下降27.4%和68.9%，使地上部的Cd含量分別下降78.0%和88.0%。Si和Zn共存時對Cd的抑制效應明顯大于單獨施加巰基硅的抑制效應，對地上部Cd積累量的抑制效應大于對根系Cd的抑制效應。

單獨添加巰基硅對水稻幼苗中的Zn含量沒有顯著影響。施加0.2 mmol·L-1Zn后，水稻幼苗根的Zn含量明顯高于地上部，鋅含量隨著添加Zn濃度的增加而大幅升高。和對照相比，Si1+Zn和Si2+Zn處理使水稻根系中的Zn含量分別提高了19倍和14倍（圖1C），使地上部中的Zn含量分別提高了10倍和6倍（圖1D）。

2.2 Si-Zn互作對水稻幼苗亞細胞組分中Cd含量及分配比例的影響

水稻根系細胞壁、細胞器和胞液組分中的Cd含量有顯著差異。Cd在幼苗根系的亞細胞分布表現(xiàn)為細胞壁＞胞液＞細胞器（圖2A），在地上部的亞細胞分布表現(xiàn)分別為細胞壁≈胞液＞＞細胞器（圖2B）。施加Si和Zn顯著降低了水稻幼苗亞細胞各組分的Cd含量。其中細胞壁和胞液中的Cd含量下降幅度較大。

如圖2A所示，和Cd處理相比，Cd+Si1處理對根系細胞壁組分中的Cd含量無顯著影響，Cd+Si2處理使根系細胞壁組分中的Cd下降了43.8%，但這2種處理使胞液組分中的Cd含量分別下降了38.7%和53.0%。Zn-Si互作顯著抑制Cd進入胞液組分的過程。Cd+Si1+Zn和Cd+Si2+Zn處理使細胞壁組分中的Cd含量分別下降了39.2%和79.8%，使胞液組分中的Cd含量分別下降了43.9%和63.7%。Zn-Si互作顯著抑制Cd進入細胞壁和胞液組分的過程。如圖2B所示，Cd+Si1和Cd+Si2處理使地上部細胞壁組分中的Cd含量分別降低了18.3%和56.4%，胞液組分中的Cd含量分別下降了14.8%和61.7%。Cd+Si1+Zn和Cd+Si2+Zn處理使細胞壁中的Cd分別下降了87.2%和91.4%，使胞液中的Cd含量分別下降了95.3%和95.4%。Si-Zn互作對根系細胞壁中Cd積累的抑制作用較弱，對胞液中Cd的積累抑制作用較強。

在根際環(huán)境中添加Si和Zn對根系和地上部亞細胞組分中的Cd分配也產(chǎn)生了顯著影響。隨著Si濃度的增加，根系細胞壁中的Cd分配比例顯著下降，和無Si的Cd處理相比，Cd+Si2和Cd+Si2+Zn處理使根系細胞壁中的Cd分配比例分別下降了10%和20.3%（圖3A）。而地上部Cd分配比例的下降主要表現(xiàn)在細胞液組分中，Cd+Si2、Cd+Si1+Zn和Cd+Si2+Zn處理使地上部細胞液中的Cd分配比例分別下降了24.4%、53.4%和51.9%（圖3B）。

圖2 Si、Zn處理對Cd脅迫下幼苗根系和地上部亞細胞中Cd含量的影響Figure2 Effects of Si and Zn supply on Cd concentrations in subcellular fraction of roots and shoots in rice seedlings under Cd stress

2.3 Si-Zn互作對水稻幼苗必需元素含量的影響

在 Cd 脅迫環(huán)境中，增加 0.05～0.1 mmol·L-1的巰基硅，根系中的Ca、Fe含量都顯著下降，Mn的含量顯著增加（表1）。和單施Si相比，同時添加Si和Zn時，根系中的K和Zn含量顯著增加，而Ca和Mn含量則顯著下降。Si-Zn共存時對水稻地上部的K、Fe和Zn含量有明顯的促進作用。從轉移因子來看，與單施Si相比，Si-Zn互作促進根系中Ca、Fe向地上部的轉運，對K、Mn的轉運有一定的抑制作用（表2）。

2.4 Si和Zn對水稻根系和地上部可溶性蛋白的影響

與單獨的Cd脅迫處理相比，添加0.05 mmol·L-1和0.1 mmol·L-1的巰基硅使根系中的可溶性蛋白含量分別上升14%和44%，Si和Zn共存時，根系中的可溶性蛋白含量可提高20%～45%（圖4A）。但地上部的可溶性蛋白含量在處理間沒有顯著差異（圖4B）。

表1 Si和Zn對水稻幼苗根系和地上部必需元素含量的影響（mg·kg-1DW）Table1 Effects of Si and Zn on essential elements in rice seedlings under Cd stress（mg·kg-1DW）

圖3 Si、Zn處理對幼苗根系和地上部亞細胞組分中Cd分配比例的影響Figure3 Effects of Si and Zn on Cd distribution in subcellular fractions of roots and shoots in rice seedlings under Cdstress

表2 Si和Zn對水稻幼苗必需元素轉移因子的影響Table2 Effects of Si and Zn on the translocation factors of essential elements in rice seedlings under Cd stress

3 討論

Si是促進水稻生長發(fā)育、提高水稻抗逆能力的有益元素，Zn則是水稻生長發(fā)育所必需的微量元素，參與多種生命活動過程。增加根際環(huán)境中的Si或Zn離子濃度能有效緩解Cd對根系的生理毒害，促進根系和地上部的生長發(fā)育[8，25-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，在含2.7 μmol·L-1Cd的營養(yǎng)液中添加低濃度的Si（0.05 mmol·L-1）對水稻根系中的Cd積累量幾乎沒有影響，當巰基硅的濃度增加到0.1 mmol·L-1時，水稻根系和地上部的Cd含量才會顯著下降。但當Si和0.2 mmol·L-1Zn共存時，低濃度的巰基硅也能顯著抑制水稻對Cd的吸收和轉運。

植物在長期的進化過程中形成了多元的解毒機制，在重金屬污染環(huán)境中，水稻能將大量的Cd固定在根系中[29]，只有少部分Cd通過維管束組織向地上部轉運。Si既能促進細胞壁的發(fā)育以及Cd與細胞壁中半纖維素的結合[30]，又能和Cd形成難移動的化合物沉淀在細胞壁或液泡中[31]，還能通過降低蒸騰作用抑制Cd從根系向地上部的轉運[32]。Zn是多種蛋白質的主要輔酶，對重金屬的跨膜運輸和進出韌皮部的過程都有重要調控作用[33-34]。在本試驗中，Si和Zn共存時對地上部的K、Fe和Zn含量都有顯著的促進作用，必需元素吸收轉運效率的提高必然會抑制相關通道對Cd的轉運，因而能使根系胞液組分中的Cd含量下降43.9%以上。隨著根系中可移動的Cd數(shù)量大幅度減少，地上部的Cd總量也顯著下降。Si和Zn互補作用使得低濃度的Si也能對Cd在水稻體內的轉運產(chǎn)生顯著的抑制效果。

圖4 Si、Zn處理對水稻幼苗根系和地上部可溶性蛋白含量的影響Figure4 Effects of Si and Zn on soluble protein of roots and shoots in rice seedlings under Cd stress

植物體內的可溶性蛋白質和可溶性糖作為滲透保護物質，有利于植物在逆境脅迫下維持細胞的結構和功能[35]。Cd脅迫通常會抑制可溶性蛋白的合成，降低酶的生物活性[11]。而Si和Zn對維持細胞內大量元素（如P、K、S）和微量元素（如Fe、Cu、Mn、Zn等）的離子平衡發(fā)揮著重要作用[36-38]。這種離子動態(tài)平衡的保持與可溶性蛋白的代謝有著密切的關系。環(huán)境中增加Si濃度不僅能顯著提高Lsi1基因的表達水平，同時還調控OsHMA3、Nramp5等許多與離子轉運、金屬硫蛋白合成等有關的基因[30，32]，因而對蛋白質代謝產(chǎn)生重要影響。當Si和Zn共存時，水稻幼苗根部的可溶性蛋白含量顯著提升，說明Cd對根系的生理傷害因Si和Zn的存在而修復。由于地上部胞液組分中的Cd含量僅相當于根系胞液中的十分之一，對細胞產(chǎn)生的生理毒害甚微，所以地上部的可溶性蛋白含量在處理間沒有表現(xiàn)出顯著差異。

4 結論

（1）在含 Cd 2.7 μmol·L-1的營養(yǎng)液中添加 0.1 mmol·L-1的巰基硅能使水稻幼苗根系和地上部的Cd含量分別下降34.7%和51.8%。

（2）Si和Zn共存時對Cd的抑制作用更加明顯，同時添加0.2 mmol·L-1Zn和0.05 mmol·L-1的巰基硅，能使水稻幼苗根系和地上部的Cd含量分別下降27.4%和78.0%。

（3）同時添加Si和Zn能促進根系對K、Ca、Fe、Zn等元素的吸收以及向地上部的轉運，并能顯著提高根系中可溶性蛋白的含量。