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        人參皂苷Rg3通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路抑制人膽囊癌裸鼠移植瘤生長的研究

        2018-12-07 09:19:04黃捷吳可人徐濤金法葉志鵬閻九亮李寧
        浙江醫(yī)學(xué) 2018年22期
        關(guān)鍵詞:膽囊癌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)灌胃

        黃捷 吳可人 徐濤 金法 葉志鵬 閻九亮 李寧

        膽囊癌是最常見的膽道惡性腫瘤之一,其致病原因尚不十分清楚,癥狀缺乏特異性,惡性程度高,進(jìn)展快,轉(zhuǎn)移早且預(yù)后不良,確診時多屬晚期[1-2],開發(fā)抑制其生長和轉(zhuǎn)移的藥物已成為一項重要課題。人參皂苷Rg3是從中藥人參中提取的單體成分,具有抑制腫瘤細(xì)胞生長、增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用,并能選擇性抑制腫

        瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、浸潤及腫瘤新生血管的形成,還能明顯提高化療療效[3-4]。本課題組前期研究證實,人參皂苷Rg3在分子水平上調(diào)C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous transcription factor,CHOP)表達(dá)并激活 Caspase12 依賴性細(xì)胞凋亡,抑制CHOP表達(dá)能夠顯著減弱人參皂苷Rg3對膽囊癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性和促凋亡作用[5]。本研究擬通過觀察人參皂苷Rg3對人膽囊癌細(xì)胞GBC-SD裸鼠移植瘤生長的作用,探討人參皂苷Rg3通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激雙鏈RNA依賴性蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(pancreatic ER stress kinase,PERK)通路抑制人膽囊癌裸鼠移植瘤生長的機(jī)制。

        1 材料和方法

        1.1 細(xì)胞來源 人膽囊癌細(xì)胞GBC-SD購自上海復(fù)祥生物科技有限公司,人膽囊癌細(xì)胞加入RPMI1640培養(yǎng)基中,放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

        1.2 實驗動物 5周齡雄性BALB/c裸鼠12只,體重約20~23g,購于常州卡文斯實驗動物有限公司,在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心SPF級動物房普通飼料喂養(yǎng),自由飲水。

        1.3 主要試劑和儀器 人參皂苷Rg3(美國Sigma-Aldrich公司,貨號:SML0184);BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Scientific公司);PERK抗體(英國Abcam公司);磷酸化 PERK(p-PERK)抗體、β-actin 抗體(美國Cell Signaling Technology公司);真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2 alpha,eIF2α)抗體(美國Proteintech 公司);脂質(zhì)運載蛋白 2(lipocalin 2,Lcn2)抗體、磷酸化 eIF2α(p-eIF2α)抗體、轉(zhuǎn)錄激活因子 4(activating transcription factor 4,ATF4)抗體(美國 Affinity Biosciences公司);羊抗兔HRP標(biāo)記二抗、羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗、RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所);Western blot實驗設(shè)備(美國Bio-Rad公司);酶標(biāo)儀(MK3,芬蘭雷勃公司);成像系統(tǒng)(Tanon-5200,上海天能科技有限公司);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司);倒置拍照顯微鏡(德國Leica公司)。

        1.4 動物模型建立 采用隨機(jī)數(shù)字表法將裸鼠分為人參皂苷Rg3灌胃組和對照組各6只。取指數(shù)生長期人膽囊癌細(xì)胞GBC-SD,用PBS洗滌3次,重懸于PBS中并調(diào)整濃度為5×106/ml,于每只裸鼠右側(cè)腹股溝皮下注射0.2ml細(xì)胞懸液(1×106/個人膽囊癌細(xì)胞GBC-SD),細(xì)胞懸液接種7d后,觀察成瘤情況。待腫瘤長至50~70mm3開始進(jìn)行灌胃處理,人參皂苷Rg3組將人參皂苷Rg3按20mg/kg劑量溶于0.2ml 0.9%氯化鈉溶液后灌

        胃,對照組用0.2ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃,1次/d,連續(xù)給藥3周。

        1.5 瘤體積和瘤體質(zhì)量測量 灌 胃處理開始后每隔3d以游標(biāo)卡尺測量腫瘤長、短徑并計算瘤體積直至第21天灌胃結(jié)束,瘤體積=(腫瘤長徑×腫瘤短徑2)/2。21d后處死小鼠,切除腫瘤并稱重后,凍存組織以備后續(xù)實驗。

        1.6 p-PERK、PERK、p-elF2α、elF2α、ATF4 和 L cn2 蛋白表達(dá)水平檢測 采 用Western blot法。取凍存組織按照RIPA裂解液說明書裂解,BCA法測定蛋白濃度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。灌制12%分離膠、5%濃縮膠的SDS-PAGE凝膠,樣品蛋白(25~40μg/樣品)通過 S DS-PAGE 電 泳,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜,PVDF膜孵育在含5%脫脂奶粉的封閉液平皿中(室溫下30min)。將一抗稀釋至適當(dāng)濃度(PERK、p-PERK、elF2α、p-elF2α、ATF4、Lcn2、β-actin稀釋度1∶1 000),加入封閉液中,4℃脫色搖床過夜,用TBST洗滌緩沖液在4℃下脫色搖床上洗滌,同上方法制備二抗稀釋液(1∶5 000),4℃下孵育 4 ~5h后,用 T BST洗滌緩沖液在4℃下脫色搖床上洗滌。加入ECL發(fā)光液,曝光后用Image J軟件分析,蛋白質(zhì)的相對表達(dá)為每個蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值的比值。

        1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采 用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組裸鼠瘤體積和瘤體質(zhì)量比較 人參皂苷Rg3灌胃組裸鼠瘤體質(zhì)量明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。灌胃9d內(nèi),兩組裸鼠腫瘤體積大小比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05);但灌胃12d開始,人參皂苷Rg3灌胃組裸鼠瘤體積較對照組均明顯減小,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01),提示人參皂苷Rg3能抑制腫瘤體積增長,見表1。

        2.2 兩組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 人參皂苷Rg3灌胃組裸鼠p-PERK、p-elF2α、ATF4和Lcn2蛋白表達(dá)水平均明顯高于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01);但兩組裸鼠PERK和elF2α蛋白表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),提示人參皂苷Rg3能夠激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK信號通路,見表2和圖1。

        3 討論

        研究表明人參皂苷Rg3能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長,但其作用機(jī)制尚不完全清楚[6-8]。本課題組前期研究表明,人參皂苷Rg3對原發(fā)性膽囊癌細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性和促凋亡作用,但是對非癌膽囊上皮細(xì)胞無影響[5]。該研究證實人參皂苷Rg3在分子水平介導(dǎo)的病理性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是其對膽囊癌細(xì)胞作用的關(guān)鍵機(jī)制。本研究則通過檢測人膽囊癌細(xì)胞裸鼠移植瘤組織中PERK 通路相關(guān)蛋白 p-PERK、PERK、p-elF2α、elF2α、ATF4和Lcn2的表達(dá)水平,探討人參皂苷Rg3對膽囊癌細(xì)胞PERK通路的作用,結(jié)果表明人參皂苷Rg3通過PERK、elF2α磷酸化,增加了下游蛋白ATF4、Lcn2表達(dá),證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路的激活,并發(fā)揮抗腫瘤作用。

        表1 兩組裸鼠移植瘤體積與瘤體質(zhì)量比較

        表2 兩組裸鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

        圖1 兩組裸鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

        近年研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路活化能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[9-11]。PERK通路是未折疊蛋白反應(yīng)信號通路的一個組成部分。在非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下,PERK與分子伴侶GRP78/Bip結(jié)合處于非活動狀態(tài);在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下,PERK與GRP78/BiP分離并被激活,PERK磷酸化后引起eIF2α失活,使細(xì)胞多數(shù)蛋白質(zhì)的合成終止,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。PERK、eIF2α磷酸化同時激活A(yù)TF4,上調(diào)CHOP表達(dá)[12]。ATF4是堿性亮氨酸拉鏈家族的成員之一,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下依賴PERK通路翻譯,在綜合應(yīng)激反應(yīng)通路的激活中起核心作用。在應(yīng)激源作用下,eIF2α磷酸化后使ATF4進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),激活下游基因表達(dá)[13]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的報道中均發(fā)現(xiàn)ATF4表達(dá)上調(diào)[14]。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一個特定轉(zhuǎn)錄因子,誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白——細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑基因表達(dá),與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)[15]。此外,各類促細(xì)胞凋亡的研究中已有CHOP表達(dá)增加的相關(guān)報道[16]。

        Lcn2也稱為中性粒細(xì)胞明膠酶蛋白,在多種實體腫瘤中均有表達(dá)上調(diào),并被證明與腫瘤進(jìn)展相關(guān)[17-19]。研究表明在前列腺癌細(xì)胞中未折疊蛋白反應(yīng)通過NF-κB依賴途徑激活Lcn2表達(dá),Lcn2在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)可能伴隨未折疊蛋白翻譯活化,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/Lcn2可能是腫瘤發(fā)展過程中的一個潛在干預(yù)靶點[20]。另有研究表明在慢性腎功能不全時清蛋白通過升高胞質(zhì)內(nèi)鈣濃度,誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng),通過ATF4、Lcn2表達(dá)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡;同時,Lcn2基因抑制能夠減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,減輕蛋白尿小鼠的腎小管間質(zhì)損傷,降低死亡率[21]。本研究也得出類似結(jié)果,人膽囊癌裸鼠移植瘤經(jīng)人參皂苷Rg3處理后Lcn2蛋白表達(dá)顯著升高。

        本研究表明人參皂苷Rg3灌胃能明顯抑制人膽囊癌裸鼠移植瘤的生長,同時人參皂苷Rg3沒有增加PERK和eIF2α蛋白表達(dá)。人參皂苷Rg3灌胃組p-PERK、peIF2α、ATF4和Lcn2蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組,表明人參皂苷Rg3能引起PERK、eIF2α磷酸化并增加ATF4、Lcn2蛋白表達(dá),證實人參皂苷Rg3在體內(nèi)激活PERK通路的重要作用,人參皂苷Rg3在體內(nèi)通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路,抑制人膽囊癌裸鼠移植瘤生長。人參皂苷Rg3可以作為有前景的抗膽囊癌藥物進(jìn)一步研究,而人參皂苷Rg3促膽囊癌細(xì)胞凋亡的其他機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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