董 強，解琪琪，胡建宏，王茂林，袁國強，潘亞文，，*

（1. 蘭 州大學第二醫(yī)院神經(jīng)外科，甘肅 蘭州730030；2. 蘭州大學第二醫(yī)院骨科，甘肅 蘭州730030；3. 蘭州大學第二醫(yī)院神經(jīng)病學研究所，甘肅 蘭州 730030）

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率占顱內(nèi)腫瘤的46%，大約占人類惡性腫瘤的1%~3%[1]。目前，膠質(zhì)瘤的治療主要以手術(shù)，以及結(jié)合手術(shù)后放化療為主[2-3]。雖然綜合治療的方式延緩了腫瘤的復(fù)發(fā)和延長了患者的生存期，但是患者預(yù)后仍較差。膠質(zhì)瘤5年生存率小于30%，膠質(zhì)母細胞瘤中位生存期只有12~15個月[4]。當前，對膠質(zhì)瘤前期診斷只能依靠影像學的方法，缺乏有效的腫瘤標記物進行早期診斷和預(yù)后監(jiān)測[5]。所以，尋找有效的膠質(zhì)瘤分子標記物，對膠質(zhì)瘤患者進行早期生存期預(yù)測和指導(dǎo)臨床治療有著重要意義。

甲酰肽受體1(formyl peptide receptor 1，F(xiàn)PR1)基因位于染色體19q13.3上，其蛋白產(chǎn)物是一種G蛋白偶聯(lián)受體，屬于FPR家族蛋白(包括FPR1、FPR2/FPRL1和FPR3/FPRL2)。據(jù)報道，F(xiàn)PR1結(jié)合含N-甲酰甲硫氨酸的寡肽而被激活，激活的FPR1可以介導(dǎo)白細胞和吞噬細胞殺死病原微生物，在先天性免疫反應(yīng)中具有重要作用[6]。FPR1/nox1依賴的氧化還原信號通路參與促進腸道黏膜創(chuàng)傷修復(fù)[7]。大量研究顯示，F(xiàn)PR1在多種癌癥中異常表達，在腫瘤的形成和發(fā)展中起著重要作用，如胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤和膠質(zhì)瘤等[8-12]。

本研究通過下載GEO數(shù)據(jù)庫中原始數(shù)據(jù)，利用R語言對膠質(zhì)瘤基因芯片表達譜數(shù)據(jù)進行差異基因篩選，通過DAVID數(shù)據(jù)庫對差異表達的基因進行基因本體論(gene ontology consortium，GO)功能富集，京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路分析。STRING數(shù)據(jù)庫及Cytoscape軟件進行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)可視化分析篩選網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的關(guān)鍵基因。再結(jié)合Oncomine及GEPIA數(shù)據(jù)庫分析FPR1在膠質(zhì)瘤組織中的表達及預(yù)后情況，為膠質(zhì)瘤分子機制的進一步研究提供線索和思路。

1 資料與方法

1.1 資料來源

通過NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫中下載膠質(zhì)瘤患者的基因表達譜數(shù)據(jù)集GSE15824。在GSE15824數(shù)據(jù)集中我們選取30例不同級別的膠質(zhì)瘤組織樣本和5例正常組織樣本進行分析。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)處理及差異基因篩選 利用R語言(3.3.0；https://www.r-project.org)“affty”包對GSE15824數(shù)據(jù)集中每個樣本探針表達值進行背景校正標準化處理。通過“l(fā)immar”包對膠質(zhì)瘤組織和正常組織中每個探針進行t檢驗和貝葉斯檢驗，以log2(Fold change)的絕對值>2.0和調(diào)整的P<0.01為篩選標準定義差異表達探針。最后通過GPL570 平臺將探針轉(zhuǎn)換成基因名稱。

1.2.2 GO和KEGG分析 DAVID(the database for annotation，visualization and integrated discovery)是一個生物信息數(shù)據(jù)庫，提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息[13]。為了分析差異表達基因的生物學功能和富集的信號通路，使用DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO和KEGG分析，利用R語言“ggplot2”包進行GO和KEGG可視化分析。

1.2.3 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò) STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)是一種預(yù)測蛋白之間相互作用的系統(tǒng)，包括蛋白之間間接相互作用的相關(guān)性[14]。將差異基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，輸出蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)文件，通過Cytoscape軟件進行可視化蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析。利用cytoscapehubba插件把網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中心的基因定義為關(guān)鍵基因(hub gene)。

1.2.4 利用Oncomine和GEPIA數(shù)據(jù)庫分析FPR1在膠質(zhì)瘤中的表達及預(yù)后 Oncomine數(shù)據(jù)庫是癌癥基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺，旨在挖掘癌癥基因信息，可用于比較癌癥和正常組織的差異表達分析[15]?；虮磉_譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析(gene expression profilling interactive analysis，GEPIA)是由北京大學研發(fā)的用于腫瘤與正常組織差異基因分析的在線分析工具?？梢赃M行差異基因與臨床病理分級、分期及生存期的相關(guān)性分析。利用Oncomine 和GEPIA數(shù)據(jù)庫驗證FPR1在膠質(zhì)瘤中的表達情況。利用Kaplan-Meier方法進行FPR1與膠質(zhì)瘤患者生存期的相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達基因

根據(jù)GEO數(shù)據(jù)庫正常組織與膠質(zhì)瘤組織的mRNAs矩陣數(shù)據(jù)，以log2(Fold change)的絕對值>2.0和P<0.01為篩選標準，總共有648個差異表達的mRNAs，其中包括471個表達上調(diào)mRNAs，177個表達下調(diào)mRNAs(圖1A)，上調(diào)和下調(diào)最顯著的前10個基因如表1。我們選取表達差異較明顯的82個mRNA[log2(Fold change)絕對值>3.0] 進行聚類熱圖分析(圖1C)。同時，我們把不同級別的膠質(zhì)瘤分別與正常腦組織比較，差異基因取交集，發(fā)現(xiàn)總共有274個不同級別膠質(zhì)瘤共同的差異基因(圖1B)。

2.2 GO和KEGG分析

通過對差異表達基因GO和KEGG分析顯示，這些差異基因富集的生物學過程主要包括T細胞的激活、調(diào)節(jié)白細胞的黏附、調(diào)節(jié)細胞的吞噬、細胞的遷移和甘油三酯的代謝有關(guān)(圖2A)。KEGG通路分析顯示，主要富集的通路包括PI3K?Akt信號通路，MAPK信號通路和鈣離子信號通路以及細胞衰老、自噬和調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架(圖2B)。這些信號通路都跟腫瘤的發(fā)生進程相關(guān)。

2.3 PPI分析和hub基因

圖1 膠質(zhì)瘤組織與正常組織中差異表達的基因

表1 膠質(zhì)瘤組織與正常組織中差異表達基因中上調(diào)和下調(diào)最顯著的前10個基因

為了進一步了解膠質(zhì)瘤和正常組織中差異基因的蛋白調(diào)控關(guān)系，尋找蛋白調(diào)控的關(guān)鍵基因，我們構(gòu)建了蛋白調(diào)控的互作網(wǎng)絡(luò)圖。通過在線分析工具STRING網(wǎng)站，根據(jù)interaction score>0.7為閾值，分析得到648個蛋白互作網(wǎng)絡(luò)節(jié)點，然而在Cytoscape軟件上進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)可視化分析(圖3)。利用cytoscapehubba插件定義前10個關(guān)鍵基因(GNG4、LPAR5、AGT、ADCY8、ADCY2、FPR1、C3、CCR1、 CXCL16、APLNR)進行進一步分析，我們發(fā)現(xiàn)FPR1和膠質(zhì)瘤患者的生存預(yù)后相關(guān)。

2.4 FPR1的表達水平與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后

圖2 差異表達基因的GO生物學功能和KEGG信號通路富集

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和hub基因

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫對每個關(guān)鍵基因Kaplan-Meier曲線進行分析。我們發(fā)現(xiàn)FPR1表達水平跟膠質(zhì)瘤患者預(yù)后相關(guān)，F(xiàn)PR1在膠質(zhì)瘤高表達總體生存率低于低表達患者(|HR|=2.8，P<0.01)(圖4A)。同時，通過對Oncomine 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進行非配對t檢驗分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PR1在膠質(zhì)瘤高表達(P=1.71×10-6)，與基因芯片篩選的結(jié)果一致(圖4B)。

3 討 論

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)中惡性程度最高，預(yù)后較差的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤。由于呈侵襲性生長的特性，腫瘤與周圍腦組織邊界不清，手術(shù)不能完全切除腫瘤組織[16]。然而，一些患者對化療和放療存在抵抗，使患者預(yù)后較差[17-19]。所以，探索膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制，尋找跟膠質(zhì)瘤早期診斷和預(yù)后相關(guān)的分子標志物是目前急需解決的問題。近年來，基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學方法成為腫瘤在分子水平進行機制研究的主要方法之一[20-22]，而基因芯片、高通量測序等現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展以及生物信息學方法的應(yīng)用為我們從分子水平探索膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展提供了很好的手段。本研究通過采用生物信息學方法比較分析了膠質(zhì)瘤組織和正常組織中差異表達的基因，定義了648個差異表達的基因，然后采用DAVID在線分析工具對差異基因進行GO功能注釋及KEGG通路分析，通過PPI網(wǎng)絡(luò)進行膠質(zhì)瘤的可視化分析和定義相關(guān)的關(guān)鍵基因。對篩選出的10個關(guān)鍵基因利用GEPIA數(shù)據(jù)庫進行生存分析，我們發(fā)現(xiàn)只有FPR1表達水平跟患者預(yù)后明顯相關(guān)。

圖4 FPR1在正常腦組織和膠質(zhì)瘤中的表達和生存曲線

在648個差異表達的基因中(包括471個表達上調(diào)，177個表達下調(diào))，進行GO功能富集和KEGG信號通路分析顯示，這些差異基因富集的生物學過程主要富集于T細胞的激活、調(diào)節(jié)白細胞的黏附、調(diào)節(jié)細胞的吞噬和細胞的遷移。細胞免疫的異?？梢源龠M腫瘤的發(fā)生，細胞遷移能力增強促進了腫瘤細胞的侵襲[23-24]。KEGG通路主要富集于PI3K/Akt，MAPK和鈣離子信號通路。之前研究顯示，這些信號通路跟腫瘤的增殖，侵襲和遷移，細胞凋亡密切相關(guān)[25-26]。在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。Snapkov等[27]研究顯示，F(xiàn)PR1在神經(jīng)母細胞瘤中高表達，F(xiàn)PR1激動劑能夠促使細胞內(nèi)鈣動員，并激活MAPK/Erk、PI3K/Akt和P38-MAPK信號通路，促進神經(jīng)母細胞瘤的增殖。此研究發(fā)現(xiàn)與我們預(yù)測的結(jié)果一致。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫對篩選出的10個關(guān)鍵基因進行生存分析顯示，只有FPR1表達水平跟患者預(yù)后明顯相關(guān)，且FPR1在膠質(zhì)瘤組織中明顯高表達，和Oncomine數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果一致(如圖4)。Logrank分析顯示FPR1的表達水平可以作為潛在的膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后標志物。

近年來研究表明，F(xiàn)PR1在多種癌癥均異常表達。FPR1在胃癌組織中比正常組織中表達量明顯增加，且與患者生存期密切相關(guān)，表達量越高患者總體生存率越低[8]。 然而Prevete等[28]認為在胃癌中FPR1是一種抑癌基因，可以抑制腫瘤血管的生成，增高FPR1的表達可以明顯抑制胃癌移植瘤的增長，跟之前的結(jié)果不一致。Chen等[12]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PR1可以促進膠質(zhì)母細胞瘤U87的侵襲和腫瘤血管形成，降低FPR1的表達，可以抑制裸鼠移植瘤的增長。Liu等[11]在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PR1可以促進NK細胞的遷移，抑制黑色素瘤細胞的增長。

綜上所述，基于生物信息學的方法，通過分析GSE15824數(shù) 據(jù)集數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)FPR1的表達水平與膠質(zhì)瘤患者總體生存期明顯相關(guān)，F(xiàn)PR1高表達的患者預(yù)后較差。FPR1可以作為潛在的預(yù)后判斷分子標志物，為進一步研究膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制提供了新思路。