李林杰，李 健，楊洪娟，林令海

（日照出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 日照 276800）

大豆是世界范圍內(nèi)的重要經(jīng)濟(jì)作物，由于我國大豆生產(chǎn)成本、市場(chǎng)交易成本較高，含油量偏低，并且美國、巴西、阿根廷等國普遍采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，且生產(chǎn)機(jī)械化程度高、成本低、含油量高，導(dǎo)致大豆進(jìn)口猛增。根據(jù)海關(guān)總署數(shù)據(jù)顯示，2017年我國大豆進(jìn)口量達(dá)到了9 554萬t，創(chuàng)下進(jìn)口量新高。進(jìn)口大豆不同于一般的植物產(chǎn)品，其本身具有活性，能夠攜帶大量的有害生物，攜帶的真菌性病害具有隱蔽性、危險(xiǎn)性，難以檢測(cè)，必須高度重視。

1 真菌性病害種類

大豆真菌性病害包括大豆胞囊線蟲病、大豆莖腐病、大豆褐斑病、大豆炭腐病、大豆菌核病、大豆疫霉病、大豆炭疽病、大豆莢（莖）枯病、大豆猝死綜合癥、大豆霜霉病、大豆灰斑病、大豆擬莖點(diǎn)種腐病、大豆莖褐腐病、大豆輪紋病、大豆褐紋病、大豆種腐病、大豆莖潰瘍病菌等。

2 我國檢疫情況

我國主要從巴西、美國、阿根廷、烏拉圭、加拿大五個(gè)國家進(jìn)口大豆，其中美國、巴西兩國大豆的進(jìn)口數(shù)量占總進(jìn)口量的90%以上。檢疫性病菌主要是大豆疫霉病菌Phytophthora sojaeKaufmann&Gerdemann、大豆莖潰瘍病菌Diaporthe phaseolorum caulivora、大豆莖褐腐病菌Phialophora gregata（Allington&Chamberlain）W.Gams、北美大豆猝死綜合癥病菌Fusarium virguliformeO'Donnell et T.Aoki（北美SDS）和南美大豆猝死綜合癥病菌Fusarium tucumaniaeT.Aoki,O'Donnell,Yos.Homma et Lattanzi（南美SDS），其中大豆莖潰瘍病菌又分為北方莖潰瘍病菌Diaporthe phaseolorum var.caulivora（DPC）、南方莖潰瘍病菌Diaporthe phaseolorum var.meridionalis（DPM）2個(gè)種，現(xiàn)南美SDS又出現(xiàn)2個(gè)新種F.brasiliense，F(xiàn).cuneirostrum。據(jù)統(tǒng)計(jì)2013年1月至2018年6月份，我國檢驗(yàn)檢疫部門在各口岸大豆中截獲的檢疫性有害病菌最多的為北方莖潰瘍病菌、南方莖潰瘍病菌、大豆疫霉病菌、大豆莖褐腐病菌，大豆猝死綜合癥病菌未檢出過。美國大豆中攜帶真菌最為嚴(yán)重。各個(gè)國家均檢出大豆疫霉病菌、北方莖潰瘍病菌，烏拉圭大豆未檢出南方莖潰瘍病菌、大豆莖褐腐病菌，加拿大未檢出大豆莖褐腐病菌（見附表）。

附表 2013年1月至2018年6月5個(gè)大豆進(jìn)口國主要檢疫性真菌截獲情況 種 次

3 檢疫性真菌分類特征

大豆疫霉病菌、大豆莖潰瘍病菌、大豆莖褐腐病菌3種病原菌分類、危害、生物學(xué)特征具體如下：

3.1 大豆疫霉病菌

3.1.1 分類地位 藻菌界，卵菌門，霜霉目，腐霉科，疫霉屬。

3.1.2 分布 歐洲：法國、意大利、匈牙利、瑞士、俄羅斯、愛爾蘭等；北美：美國、加拿大等；南美：巴西、阿根廷；亞洲：中國（黑龍江、吉林、北京）、日本、韓國、以色列、巴基斯坦；大洋洲：澳大利亞。

3.1.3 寄主 大豆疫霉病菌寄生專化性很強(qiáng)，寄主范圍并不廣泛，可侵染大豆、羽扇豆屬、菜豆和豌豆。

3.1.4 傳播途徑 大豆疫霉病菌是典型的土傳真菌病害，大豆疫霉病的發(fā)生與降水量、土壤類別、耕作情況、栽培品種等多種因素密切相關(guān)。

3.1.5 形態(tài)及生物學(xué)特征 大豆疫霉菌在PDA培養(yǎng)基上生長緩慢，菌落均勻，白色，邊緣不整齊；氣生菌絲致密，呈棉絮狀。在利馬豆、V8汁等培養(yǎng)基上生長較快，菌落均勻，邊緣整齊。大豆疫霉菌喜歡生活在潮濕涼爽的環(huán)境中，菌絲生長最適溫度為25～28℃，最高為32～35℃，最低為5℃。營養(yǎng)體為發(fā)達(dá)的無隔菌絲體，菌絲寬3～9 μm，易卷曲；菌絲體珊瑚狀；菌絲可形成菌絲膨大體和厚垣孢子。胞囊梗無特殊分化，頂生游動(dòng)孢子囊。游動(dòng)孢子囊倒梨形、橢圓形或長筒形，無乳突。游動(dòng)孢子卵圓形，一端或兩端鈍圓，側(cè)面平滑，有兩根鞭毛，尾鞭長度是茸鞭的4～5倍；藏卵器球形或亞球形，直徑29～58 μm，壁薄。雄器多為長形，側(cè)生，偶圍生。

3.2 大豆莖潰瘍病菌

3.2.1 分類地位 真菌界，子囊菌門，糞殼菌綱，間座殼菌目，間座殼菌科。

3.2.2 分布DPC分布：亞洲：韓國；歐洲：保加利亞、克羅地亞、法國、意大利、俄羅斯、西班牙、賽爾維亞；北美洲：加拿大、美國；南美洲：阿根廷、巴西、厄瓜多爾。DPM分布：歐洲：意大利；北美洲：美國；南美洲：阿根廷、巴西、玻利維亞、巴拉圭；非洲：加納、尼日利亞、坦桑尼亞。

3.2.3 寄主 在自然條件下只侵染大豆。

3.2.4 傳播途徑 病原菌以菌絲的形態(tài)存活于種子內(nèi)傳播。此外，病菌還以菌絲和子囊殼的形態(tài)在大豆病殘?bào)w上越冬，并隨病殘?bào)w作遠(yuǎn)距離傳播。

3.2.5 形態(tài)及生物學(xué)特征 在PDA上適宜的生長溫度25℃，pH 6～7。美國北方菌株在PDA上菌落白色，致密，菌絲叢生，從培養(yǎng)基背面觀察，菌落無色。具黑色、圓形的子座，直徑小于2 mm，彼此不融合。子囊殼黑色，球形，大?。?65～340 μm）×（282～412 μm），具長而突出的喙，長度24～518 μm，基部寬85～192 μm，頂部22～36 μm。具有一個(gè)薄的很快消失的壁，子囊孢子透明，長圓至橢圓形，雙胞，大?。?～12 μm）×（3～4 μm）。美國南方菌株的菌落白色，平展，具厚垣孢子而呈褐色，長度2～10 μm，偶爾融合形成較大子座，子囊殼形態(tài)兩者相似，但喙的基部寬度是北方的2倍。子囊和子囊孢子也與北方相似，但要更大一些，子囊大?。?5.8～37.1 μm）×（6.7～7.0 μm），子囊孢子大小（9.5～9.8 μm）×（3.1～3.4 μm），該病菌是同宗配合、子囊殼由單個(gè)子囊孢子培養(yǎng)而成，連續(xù)光照可抑制子囊殼和子囊孢子的產(chǎn)生。

3.3 大豆莖褐腐病菌

3.3.1 分類地位：真菌界，子囊菌門，散囊菌綱，刺盾炱目，小蔓毛殼科。

3.3.2 分布 亞洲：日本；歐洲：克羅地亞、黑山、塞爾維亞；非洲：埃及；北美洲：加拿大、墨西哥、波多黎各（美）、美國；南美洲：阿根廷、巴西。

3.3.3 寄主 大豆是主要的具有經(jīng)濟(jì)意義的寄主。

3.3.4 傳播途徑 病菌自身的傳播力低，能隨種子間夾雜的病殘?bào)w或可能潛伏在種子內(nèi)進(jìn)行傳播。

3.3.5 形態(tài)及生物學(xué)特征 病菌在15～29℃大豆萃取液培養(yǎng)基上快速地產(chǎn)孢，產(chǎn)孢細(xì)胞呈瓶梗狀，4～15 μm，透明，無或有隔膜，直或燒瓶狀。著生方式有單生、側(cè)生或頂生存在于菌絲頂端，菌絲直徑1.2～4.7 μm，透明，有隔膜，分叉。分生孢子聚集在孢子梗頂端粘液中，呈不規(guī)則球狀，而非串生，新形成分生孢子球碰到水就會(huì)散開。

4 檢疫性真菌檢疫方法

4.1 檢查與取樣

仔細(xì)檢查有無土塊、病殘?bào)w、蟲癭等真菌的子實(shí)體；有無發(fā)霉、腐爛、病斑、腫塊、開裂、變色、畸形或發(fā)育不正常的種子。重點(diǎn)抽取具有典型或有可疑癥狀的種子和土塊。

4.2 直接檢查

4.2.1 感官檢驗(yàn) 用低倍放大鏡或者直接肉眼檢查外表面有明顯癥狀的種子、可見的病原物子實(shí)體。

4.2.2 解剖檢查 如果檢查到病殘?bào)w、蟲癭或菌癭等結(jié)構(gòu)組織，徒手切片或者冰凍切片或石蠟切片，制片檢查。必要時(shí)染色檢查，記錄形態(tài)特征測(cè)量大小，并進(jìn)行鑒定。

4.3 洗滌鏡檢法

適用樣品：進(jìn)境糧谷種子病常規(guī)檢測(cè)，病殘?bào)w及篩下物中病原孢子的收集。

4.4 保濕培養(yǎng)法

適用樣品：大豆南北方莖潰瘍病菌、大豆莖褐腐病菌。

4.4.1 種子冷凍保濕培養(yǎng) 挑選變色、畸形或皺縮種子等不健康種子，用1.25%的次氯酸鈉（NaCLO）溶液表面滅菌3～4 min后，放在墊3層滅菌濕濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿10粒，在室溫（20～22℃）狹放置24 h后，在-20℃下冷凍24 h，然后轉(zhuǎn)至25℃培養(yǎng)箱或培養(yǎng)架上培養(yǎng)7 d，近紫外光照和黑暗各12 h交替。

4.4.2 植物殘?bào)w保濕培養(yǎng) 植物殘?bào)w在75%的酒精溶液中浸泡1 min，經(jīng)無菌水洗滌后放置在墊3層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，在22～25℃培養(yǎng)箱或培養(yǎng)架上培養(yǎng)，近紫外光照和黑暗各12 h交替。

4.4.3 培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定7 d后觀察種子表面或植物殘?bào)w表面是否有特征真菌菌落生長，則移至PDA或其他選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行后繼鑒定。

4.5 組織培養(yǎng)法

4.5.1 病殘?bào)w選取 有病害癥狀的病殘?bào)w，用自來水沖洗干凈后，浸入70%酒精中30 s，取出后放入無菌水中漂洗，然后于1%NaClO溶液中消毒3～5 min，無菌水漂洗2遍后，在吸水紙上晾干，切成合適大小放于酸性PDA培養(yǎng)基上（100 mL）培養(yǎng)基中加入（0.4 mL）在22～25℃培養(yǎng)箱或培養(yǎng)架上培養(yǎng)，近紫外光照和黑暗各12 h交替。

4.5.2 培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定 種子須經(jīng)浸泡充分吸水和冷凍過夜處理后再進(jìn)行上述步驟。3 d后觀察種子表面或植物殘?bào)w表面是否有特征真菌菌落生長，則移至另一皿PDA或其他選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行后繼鑒定、制片、觀察。

4.6 寄主誘捕法

適用于土塊中疫霉菌的檢測(cè)，如大豆疫霉菌。

4.6.1 選取土塊 選取進(jìn)境糧谷中土塊，而不是病殘?bào)w與粉塵集結(jié)形成的塊狀物，真正的土塊較重、較結(jié)實(shí)，有土味，而塊狀物呈輕、較疏松易分開，有一股豆腐爛的味道。

4.6.2 處理土樣 稱量土樣每份10 g，用斧頭砸碎，除去植物組織、石塊等雜質(zhì)，均勻平鋪在直徑90 mm滅菌培養(yǎng)皿中。

4.6.3 浸潤土壤與孵育卵孢子 每皿土樣緩慢加入4～7 mL含有殺菌劑的無菌水，使土壤均勻濕潤（土壤含水量大約為35%），加蓋后用parafilm膜封口，將濕潤并封好口的土樣置于22～26℃、光照條件下放置4～6 d，孵育卵孢子萌發(fā)。

4.6.4 葉碟誘集孢子加感病大豆品種葉片（葉碟）黑暗條件誘集12～24 h，取出葉碟，水洗后放在蒸餾水中培養(yǎng)。

4.6.5 培養(yǎng)和檢查葉碟 將誘集后的大豆葉碟取出，滅菌蒸餾水沖洗2次，移到具15～20 mL滅菌蒸餾水的培養(yǎng)皿內(nèi)，22～26℃光照條件下培養(yǎng)24～72 h，然后在體視顯微鏡下檢查葉碟邊緣和表面有無孢子囊。

4.6.6 游動(dòng)孢子萌發(fā)。將有孢子囊的葉碟轉(zhuǎn)移到具1 mL左右滅菌蒸餾水的5 mL燒杯中，待孢子囊釋放出游動(dòng)孢子后（一般需1～4 h），吸取該懸浮液至半選擇性培養(yǎng)基平板上，置于22～26℃、黑暗條件下培養(yǎng)，使游動(dòng)孢子萌發(fā)。

萌發(fā)游動(dòng)孢子的單孢分離及培養(yǎng)。游動(dòng)孢子培養(yǎng)4～24 h后，在體視顯微鏡下挑取萌發(fā)的單個(gè)游動(dòng)孢子至半選擇性培養(yǎng)基平板上，置于22～26℃、黑暗條件下培養(yǎng)。

4.6.7 制片鏡檢 進(jìn)行孢子囊的形態(tài)觀察和測(cè)量時(shí)，連同葉碟取出制片。鏡檢時(shí)，注意觀察孢子囊的形狀、大小、有無乳頭狀突起和孢子囊梗的生長方式。

4.7 分子生物學(xué)方法

傳統(tǒng)的病原真菌診斷方法一般是依靠菌落形態(tài)、發(fā)病癥狀觀察等方法進(jìn)行，這些方法存在耗時(shí)費(fèi)力、靈敏度不高且不能直接從植物種子及組織中檢測(cè)到病原菌。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展及PCR技術(shù)的出現(xiàn)，大部分問題得到解決。

4.7.1 培養(yǎng)物核酸的制備 收集分離培養(yǎng)所得的菌絲，于研缽中液氮冷凍后研磨，采用CTAB法或試劑盒法提取病原菌總DNA。

4.7.2 普通PCR法

（1）PCR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)可以使用天根產(chǎn)的2*Taq MasterMix試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增；也可以自配25 μL體系擴(kuò)增，包括2.5 μL 10×PCR緩沖液，Mgcl2（2.5 mmol/L）1.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）1 μL、0.25 μL上下游引物（20 μmol/L），Taq聚合酶（5 U/μL）0.25μL。反應(yīng)體系為25 μL，加入相應(yīng)濃度得模板DNA之后，剩余體積用無菌超純水補(bǔ)足。

（2）反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，循環(huán)35次；最后72℃5 min。

（3）以無菌去離子水為空白對(duì)照，以提供的陽性對(duì)照的DNA為陽性對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)2次。

（4）擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠1×TAE緩沖液電泳，EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。純化回收條帶送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)。

4.7.3 Taq Man MGB探針實(shí)時(shí)熒光法

（1）擴(kuò)增條件 反應(yīng)體系總體積為10 μL，各成分分別為：實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)混合液Taq Man Master Mix 5 μL，10 μmol/L的1對(duì)引物和探針等比例混勻后取 1 μL，滅菌去離子水 3 μL，DNA 1 μL（10～100 ng）。將反應(yīng)體系混勻后置于實(shí)時(shí)熒光PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。

（2）以滅菌去離子水作空白對(duì)照，以所測(cè)檢疫性病菌的DNA作為陽性對(duì)照，以非檢疫性真菌的DNA作為陰性對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)2次。

（3）設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)條件為50℃預(yù)熱2 min，95℃變性10 min，然后進(jìn)入40個(gè)循環(huán)，95℃15 s，60℃1 min。讀取Ct值。

（4）結(jié)果判定與表述 在陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果均正常的情況下，則：

檢測(cè)Ct值小于或等于36，判定所檢病菌結(jié)果呈陽性；

檢測(cè)Ct值小于或等于40，判定所檢病菌結(jié)果呈陰性；

檢測(cè)Ct值在36～40，應(yīng)重做實(shí)時(shí)熒光PCR，再次擴(kuò)增后，如Ct值小于或等于36或者Ct值大于或等于40，判定同上。