龔建康，田維貴，葉 坪

（昭通學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昭通 657000）

關(guān)鍵字：亞硝酸鹽； 香腸； 分光光度檢測法

亞硝酸鹽在對于食品企業(yè)而言是一種食品添加劑，最常見的是鉀鹽類和鈉鹽類，在食品的生產(chǎn)、加工和運(yùn)輸過程中，往往需要添加護(hù)色劑和防腐劑以保證食品的色澤和延緩食品的腐敗[1].在一些肉類食品中的肌紅蛋白被亞硝酸分解產(chǎn)生的NO形成穩(wěn)定的亞硝基肌紅蛋白而起到護(hù)色劑的作用[2].同時，亞硝酸鹽在肉類產(chǎn)品中會阻礙大量的微生物繁殖，因此，亞硝酸鹽也經(jīng)常起到防腐劑的作用.但是，人體攝入過量的亞硝酸鹽，F(xiàn)e2+-血紅蛋白被氧化為Fe3+-血紅蛋白，導(dǎo)致血紅蛋白失去輸氧功能，最終人體容易患上高鐵血紅蛋白癥[3].亞硝酸鹽在加工和胃腸道中會被轉(zhuǎn)化為亞硝胺類物質(zhì)，該物質(zhì)已經(jīng)有報道，其具有致畸形和致癌的風(fēng)險[4].因此，亞硝酸鹽的安全性一直是人們的關(guān)注熱點(diǎn)，世界各國都在保證產(chǎn)品質(zhì)量和安全的前提下嚴(yán)格控制亞硝酸鹽的使用.在我國的食品安全法中規(guī)定這類食品添加劑在肉制產(chǎn)品中的殘留量應(yīng)低于30 mg/kg[5-7]，所以對肉質(zhì)食品中添加的亞硝酸鹽進(jìn)行檢測，對于食品企業(yè)的生產(chǎn)監(jiān)督和對消費(fèi)者的飲食安全都具有非常重要的意義.

目前，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)法中亞硝酸鹽的測定方法主要有鎘柱法、離子色譜法和分光光度法[8-10]，其中前兩種方法的分析技術(shù)要求較高，檢測費(fèi)用昂貴，不便于基層實(shí)驗(yàn)使用.而檢測亞硝酸鹽的分光光度法具有操作快捷和儀器設(shè)備成本低等優(yōu)點(diǎn)在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)平臺中普遍應(yīng)用[7]，該方法的原理（圖1）為：經(jīng)過沉淀蛋白質(zhì)和除去脂肪后的樣品，在酸性體系中，樣品中的NO2-在顯色劑（4-氨基苯磺酸：α-萘乙二胺鹽酸=1，體積比1:1）的作用下，發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)形成的紫紅色產(chǎn)物在λmax的可見光下有最大吸收現(xiàn)象，根據(jù)工作曲線可以獲得樣品中亞硝酸鹽含量[11-13].因此，本文采用分光光度法檢測昭通學(xué)院新校區(qū)周圍市售常食用的香腸和部分火腿腸（雙匯、美好、金鑼等多種品牌）中亞硝酸鹽含量，目的在于為相關(guān)的食品監(jiān)督管理部門和消費(fèi)者購買香腸或火腿腸時提供購買的意向和科學(xué)依據(jù).

圖1 亞硝酸鹽與鹽酸萘乙二胺偶合反應(yīng)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

7200型可見光分光光度計(jì)（尤尼柯有限公司）、TD3002電子精密天平（上海上平儀器公司）、HH-S26s恒溫水浴鍋（金壇市晶玻試驗(yàn)儀器廠）和研缽等.

1.2 材料與試劑

（1）樣品：香腸和火腿腸（購于昭陽區(qū)各超市）.

（2）試劑：見表1.

表1 實(shí)驗(yàn)主要使用的化學(xué)試劑

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制實(shí)驗(yàn)中常用的溶液的配制方法和要求，見表2.

表2 實(shí)驗(yàn)常用溶液的配制

1.3.2 最佳顯色時間的測定

于25mL棕色容量瓶中，加入NaNO2標(biāo)準(zhǔn)使用液2.00mL，4.5mLNH4Cl溶液、2.5mL 60%HAc和5mL顯色劑，定容至刻度，避光放置5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min 和40min，測定不同放置時間后體系的吸光度，繪制顯色時間和吸光度的曲線，平行實(shí)驗(yàn)次數(shù)為3次，獲得最佳顯色時間.

1.3.3 最大吸收波長的測定

吸取2.00mLNaNO2標(biāo)準(zhǔn)使用液加入到25mL棕色容量瓶中，然后加入 4.5mLNH4Cl、2.5mL60%HAc、5mL顯色劑后，定容，在避光處放置最佳顯色的時間.以10nm為梯度，在490nm～600nm波長區(qū)間，測定該溶液的吸光度，然后作測得的吸光度與波長的關(guān)系曲線，平行實(shí)驗(yàn)3次，獲得λmax.

1.3.4 NaNO2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

吸 取 5μg/mLNaNO2標(biāo) 準(zhǔn) 使 用 液 0.00mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL加入7個25mL的棕色容量瓶中，在各容量瓶中加入4.5mLNH4Cl溶液、2.5mL60%HAc、5mL顯色劑，蒸餾水定容到刻度，在避光處靜置最佳顯色時間，以0.00mL容量瓶作參比，在λmax處測定各瓶中溶液的吸光度，以吸光度對NaNO2的含量作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線.

1.3.5 樣品處理

用電子天平準(zhǔn)確稱取10g校園周邊的市售香腸或火腿腸，在粉碎機(jī)中粉細(xì)，依次加入70mL水、12mLNaOH，使香腸或火腿腸試樣呈堿性，將溶液移入至容量瓶（250mL），然后加入ZnSO4溶液10mL，充分搖勻，調(diào)節(jié)pH至弱堿性，于60℃水浴中恒溫處理10min，然后冷卻至室溫，定容，過濾，棄去初始過濾液20mL，再收集濾液測定其NaNO2含量[14].

1.3.6 樣品的測定

吸取所得樣品濾液10.00mL加入到25mL棕色容量瓶中，按2.3.4步驟進(jìn)行，測定.

1.3.7 回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取香腸或火腿腸樣品試液10mL兩份，一份按樣品的測定步驟進(jìn)行處理，另一份再加入亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液0.5mL(相當(dāng)于2.5μg)，按相同的方法進(jìn)行溶液的制備，測定含量，計(jì)算回收率[15].

1.4 相關(guān)的計(jì)算公式

1.4.1 亞硝酸鹽的含量的計(jì)算公式[16]

式中X：樣品亞硝酸鹽的含量（mg/kg）；m：測定用樣液中亞硝酸鹽質(zhì)量（μg）；ms：樣品質(zhì)量（g）；V1：樣品處理總體積（mL）；V2：測定用樣液體積（mL）.

1.4.2 加標(biāo)回收率的計(jì)算公式[17]

2 結(jié)果與討論

2.1 顯色時間的測定

圖2 吸光度和顯色時間的關(guān)系圖

為了得到該光度法中的最佳顯色時間，根據(jù)不同的顯色時間和吸光度繪制的吸光度和反應(yīng)時間的關(guān)系圖，如圖2所示，根據(jù)圖2，在25min時，顯色劑與溶液反應(yīng)，所測定的吸光度具有最大值，表明此時的測定效果最佳.因此選擇25min作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的顯色時間.

2.2 最大吸收波長的測定

圖3 吸光度隨波長變化

為了獲得λmax，以λ作為圖的橫坐標(biāo)，A作為圖的縱坐標(biāo)，作NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度和不同波長的關(guān)系圖，結(jié)果如圖3所示，圖中表明在540nm處亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液有最大吸收，因此，選用540nm作為λmax.

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

為了獲得工作曲線的線性方程，以工作液NaNO2的含量為圖的橫坐標(biāo)，實(shí)驗(yàn)測得的吸光度為圖的縱坐標(biāo)，作NaNO2標(biāo)準(zhǔn)含量和吸光度的關(guān)系曲線，對曲線進(jìn)行擬合后得到線性的方程式，結(jié)果如圖4所示，得到的線性回歸方程：y=0.0219x-0.0064，R2=0.9992，曲線線性方程的線性較好，可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)計(jì)算使用.

圖4 NaNO2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖

3.4 樣品中亞硝酸鹽的含量

用分光光度法對昭通學(xué)院新校區(qū)周圍采購的多種品牌，共9種香腸和3種火腿腸進(jìn)行了亞硝酸鹽含量的測定，各香腸或火腿腸樣品均在相同的條件下進(jìn)行測定，平行測定的次數(shù)為3次，依據(jù)工作曲線計(jì)算各樣品亞硝酸鹽的含量、同時進(jìn)行了（RSD）的計(jì)算，結(jié)果見表3.

表3 樣品亞硝酸鹽的含量

根據(jù)表3中的數(shù)據(jù)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.009%～0.133%之間，表明這種分光光度法（鹽酸萘乙二胺法）測定亞硝酸鹽含量的結(jié)果準(zhǔn)確性較好.所有樣品的亞硝酸鹽含量在1.178mg/kg～9.893mg/kg之間，其中金鑼泡面伴侶香腸中亞硝酸鹽的含量最高（9.893mg/kg），雙匯火腿腸中亞硝酸鹽的含量最低（1.178mg/kg），所測9種香腸和3種火腿腸樣品均符合我國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn).

3.5 部分樣品回收率測定

回收率的測定是實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常用以自控的一種質(zhì)量控制方法，是為了保證實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度[10].在測定樣品的過程中，在各樣液中加入2.5μg的NaNO2，用相同的方法用分光光度計(jì)測定吸光度，將所測得到的結(jié)果減去樣液的測定值，計(jì)算樣品的回收率，得到結(jié)果如表4所示.

從表4中，可以得到6種香腸和1種火腿腸樣品中亞硝酸鈉加標(biāo)回收率在89.50%～109.59%范圍內(nèi)，這進(jìn)一步可以說明本方法的準(zhǔn)確度滿足香腸或火腿腸中亞硝酸鹽測定的要求.

表4 部分樣品回收率的測定

4 結(jié)論

亞硝酸鹽和亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化物都會對人體的健康存在潛在的危害，所以在食品的生產(chǎn)過程中加入亞硝酸鹽的添加量要嚴(yán)格控制和監(jiān)督，為食品安全站崗護(hù)航，減少食品添加劑添加量超標(biāo)而對人體造成傷害.本研究以540nm為波長，25min為顯色時間為實(shí)驗(yàn)條件，所選擇的9種香腸和3種火腿腸樣品經(jīng)測定其亞硝酸鹽含量在1.178mg/kg～9.893mg/kg之間，均符合國家對于食品添加劑的使用標(biāo)準(zhǔn)，消費(fèi)者在選擇購買香腸或火腿腸類食品時，可以作為購買的科學(xué)參考依據(jù).實(shí)驗(yàn)獲得的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992，測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.009%～0.133%，說明本實(shí)驗(yàn)方法成熟，具有可操作性.回收率范圍為89.50%～109.59%之間，方法的準(zhǔn)確度較高.