易 喻，代茹楠，張彥璐，陳建澍，應國清*

（浙江工業(yè)大學藥學院，浙江 杭州 310014）

天然殼聚糖是一種高分子量的直鏈多糖，由β-（1-4）-2-乙酰胺基-2-乙酰胺基-2-脫氧-β-D-葡萄糖和 β-（1-4）-2-氨基-2-乙酰胺基-2-脫氧-β-D-葡萄糖交替結合而成，在自然界中非常豐富，是昆蟲和甲殼類動物外骨骼的組成成分[1]。殼聚糖無毒害[2]，擁有良好的生物降解能力[3]，生物相容性[4]，無抗原性[5]，抑菌性[6]和促進傷口愈合的能力[7-8]。殼聚糖在農業(yè)、環(huán)境保護、制藥、醫(yī)學以及食品工業(yè)上都有廣泛的應用[9-10]。然而由于殼聚糖只能溶于pH=6.5以下的酸性水溶液中 （如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸等）[11]，因此相關的應用受到了很大的限制。殼聚糖本身的剛性結構和分子內強烈的氫鍵作用是導致其水溶性差的主要原因，改善殼聚糖的水溶性通常有三種途徑：①控制殼聚糖的脫乙酰度[12-13]，對高脫乙酰度高的殼聚糖進行?；磻茐臍ぞ厶窃兄旅芫w結構，使其脫乙酰度（DD）控制在50%左右；②將殼聚糖在適當條件下降解為低分子量（<5000 D）的水溶產物[14]。③ 利用殼聚糖分子結構中的羥基和氨基的反應活性，在其分子鏈上引入親水基團，并破壞分子內的氫鍵作用。?；痆15]、季胺化[16]、羧甲基化[17]均能削弱分子內氫鍵從而增加了殼聚糖的水溶性。已有的研究和實踐已獲得一些階段性的結果[18-20]，但還有些問題值得進一步研究，如-OH和-NH2，哪個是改善水溶性的關鍵等。

因此，本論文利用不同的反應原理定向在殼聚糖的-OH或者-NH2上修飾上同樣的疏水基團苯甲?；?，表征后研究N-苯甲酰殼聚糖和O-苯甲酰殼聚糖之間的溶解性的差異，分析差異產生的原因。

1 材料與方法

1.1 材料

殼聚糖（DD ≥ 90%，MW=205 kD）（浙江澳興生物技術有限公司）、苯甲酰氯（上海生物化工有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 N-苯甲酰殼聚糖的制備

在室溫下，將1.0 g殼聚糖溶于45 mL 0.2 mol/L的HCl水溶液，然后加入15 mL丙酮，攪拌15 min，向上述溶液加入2 mL吡啶，繼續(xù)攪拌15 min。將2.0 e.q.-NH2的苯甲酰氯溶于15 mL丙酮，用恒壓滴定漏斗緩慢滴加到殼聚糖的HCl/丙酮/吡啶混合溶液中，50℃攪拌反應3 h。反應結束后將溶液傾倒入400 mL丙酮中得到沉淀，抽濾得到固體，固體再用丙酮和無水乙醇洗滌3～5次，加30 mL水溶解后放入透析袋中透析3～5 d，凍干后得到N-苯甲酰殼聚糖。

圖1 N-苯甲酰殼聚糖1的合成路線

1.2.2 O-苯甲酰殼聚糖的制備

在室溫下，1.0 g殼聚糖溶于15 mL甲磺酸中，攪拌15 min至完全溶解，之后將上述溶液放置于0℃冰浴，待溶液的溫度達到冰浴溫度后，向反應液中一邊攪拌一邊緩慢滴加苯甲酰氯，手工攪拌1 h后于室溫下攪拌反應3 h，最后放置于-20℃冰箱過夜。次日取出反應液，放于室溫使之融解，立即與200 mL冰水混合，抽濾取沉淀，沉淀用30 mL水溶解后用2 mol/L的NaOH溶液中和至中性，用丙酮沉淀后取沉淀，用無水乙醇和丙酮洗3～5次后溶于30 mL純水，加入透析袋透析3～5 d，之后凍干得到O-苯甲酰殼聚糖。

圖2 O-苯甲酰殼聚糖2的合成路線

1.2.3 殼聚糖脫乙酰度測定

根據文獻[21]的酸堿滴定法，準確稱量0.20 g烘干到恒重的殼聚糖及其衍生物樣品，溶于20.00 mL 0.1 mol/L經標定的鹽酸溶液中，加入甲基橙和苯胺藍的混合指示劑，用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液滴定，溶液顏色從紫紅變藍綠色。每個樣品的脫乙酰度測定三次，取平均值為樣品的脫乙酰度。

1.2.4 殼聚糖衍生物取代度的測定

（a）N-糖基化殼聚糖的氨基取代度可由以下公式計算：

（b）通過1H NMR對殼聚糖骨架C2-C6上H以及取代基上的H進行積分，根據以下公式計算得到N-或O-取代殼聚糖衍生物的修飾率：

式中：n為取代基上的H的個數。

1.2.5 殼聚糖衍生物溶解度的測定

參照文獻[22]的方法，精確稱取0.05 g殼聚糖衍生物，加入5 mL去離子水，機械攪拌3 h，然后用0.45μm孔徑的微孔濾膜過濾，未通過濾膜的物質干重設為m1，則這種衍生物的溶解度 =（0.05-m1）/5×100，單位為 g/100 mL。

1.2.6 表征

（1）FTIR 光譜

將樣品研碎后與KBr粉末混合壓片，在紅外光譜儀上進行測定，找出相關基團的特征吸收峰。

（2）核磁共振 NMR

樣品溶于D2O或者D2O和DCl的混合溶劑，作1H NMR。

2 結果與討論

2.1 FTIR光譜

圖 3（a）為殼聚糖原料的紅外譜圖，圖中593 cm-1為O-H面外彎曲，665 cm-1為N-H面外彎曲，1083 cm-1為C-OH的伸縮振動吸收峰，1384 cm-1處為CH3的對稱變形振動 （酰胺III帶），1597 cm-1處為氨基N-H的變形振動峰，2873 cm-1為C-H伸縮振動峰，3264cm-1為N-H伸縮振動吸收峰，3425 cm-1為O-H的伸縮振動吸收峰。

圖3（b）為N-苯甲酰殼聚糖的紅外譜圖，新出現在1633 cm-1處的吸收為二級酰胺 （酰胺I帶）C=O的伸縮振動，出現在1533 cm-1處的吸收為苯環(huán)的骨架振動吸收峰，3264 cm-1處的吸收減弱說明了苯甲酰化發(fā)生在C2-NH2上；1083 cm-1處的吸收峰幾乎沒有變化，說明殼聚糖的-OH不參加反應。

圖3（c）為O-苯甲酰殼聚糖的紅外譜圖，從上至下分別為投料比（殼聚糖：苯甲酰氯）為1：1，1∶2和1∶4的產物。從圖上可以看出：

（1）當投料比為1∶1時，能夠說明殼聚糖C2-NH2發(fā)生?；磻奈辗遄兓癁椋?637 cm-1處的新吸收峰為二級酰胺（酰胺I帶）C=O的伸縮振動說明有酰胺鍵生成，1597 cm-1處的吸收減弱說明C2的-NH仍在，3264 cm-1處的吸收減弱頁說明C2-NH2上也發(fā)生了苯甲?；徽f明殼聚糖-OH發(fā)生?；磻奈辗遄兓癁椋?715 cm-1處出現的C=O伸縮振動吸收峰說明-OH發(fā)生?；酋；潭炔桓?，1083 cm-1處C-OH的伸縮振動吸收峰遷移至1049 cm-1也說明了這點。說明苯環(huán)存在的變化為：新的苯環(huán)特征吸收峰716 cm-1出現。

（2） 當投料比為 1∶2時，1720 cm-1處 C=O伸縮吸收變得更強，苯環(huán)吸收峰716 cm-1也變強，出現新的苯環(huán)伸縮振動峰1601 cm-1和684 cm-1，這些都說明DS較投料比1∶1時有所上升。

（3）當投料比為1∶4時，圖形和投料比1∶2時類似，1548 cm-1處酰胺II帶吸收加強，說明C2-NH2進一步參與反應，DS在進一步增加。

（4） 當投料比為 1∶6 時，1720 cm-1處 C=O伸縮吸收進一步加強，3062 cm-1處的苯環(huán)C-H伸縮振動繼續(xù)變強。

2.2 1H NMR核磁分析

如圖4所示，1為N-苯甲酰殼聚糖的氫譜（D2O），2為O-苯甲酰殼聚糖的氫譜，且自上往下依次為投料比 （殼聚糖： 苯甲酰氯）1∶1（D2O&CF3COOD），1 ∶2（DMSO），1 ∶4（DMSO）和1∶6（DMSO）的產物的氫譜。

N-苯甲酰殼聚糖：δ=1.9為乙酰基的甲基上3個 H，δ=2.75為殼聚糖骨架 C3上的 H，δ=3.53～3.80為殼聚糖骨架 C2，C4，C5和 C6上的 5個H，δ=4.86為殼聚糖骨架C1上的一個H，δ=7.34～7.52為苯環(huán)上C2-C4上的3個H，δ=7.67～7.74為苯環(huán)上C1和C5上的2個H。

O-苯甲酰殼聚糖：（1）1∶1∶δ=1.88為乙?；募谆?個H，δ=3.45～3.96為殼聚糖骨架C2，C4，C5和 C6上的 5個 H，δ=4.75為殼聚糖骨架 C1上的 H，δ=7.2為 N-H，δ=7.40～7.53為苯環(huán)上 C2-C4和 C2’-C4’上的 6個 H，δ=7.80～7.91 為苯環(huán)上 C1，C5，C1’和 C5’上 4 個 H；（2）1∶2～1∶6∶δ=3.00～4.20為殼聚糖骨架上的 7個H，δ=7.2為 N-H，δ=7.40～7.53為苯環(huán)上 C2-C4和 C2’-C4’上的 6個 H，δ=7.80～7.91為苯環(huán)上C1，C5，C1’和 C5’上 4 個 H。

通過積分計算可得物質1的DS為0.52，21∶1的 DS為 0.43，21∶2的 DS為 0.53，21∶4的 DS為 0.75，21∶6的 DS為 1.08。

2.3 殼聚糖衍生物的溶解性

圖 3 殼聚糖 0（a），N-苯甲酰殼聚糖 1（b），O-苯甲酰殼聚糖 2（c）的 FTIR 譜圖

苯環(huán)是一種疏水性基團，微溶于水，溶于大多數有機溶劑。苯甲?；鶊F的引入能夠阻礙分子內和分子間氫鍵的形成，從而改變殼聚糖衍生物的溶解性能。如表1所示，殼聚糖原料只溶于0.2 mol/L AcOH溶液，而DS＞0.44的N-苯甲酰殼聚糖開始表現出水溶性，DS為0.52的樣品溶于任何pH值的水溶液，苯環(huán)的作用更類似于一個“物理上的支架”，因此衍生物的溶解性不受pH值的影響，在純水中的溶解度可達10.7 g/L，配成25 g/L的濃度也能夠形成透明的凝膠狀物質。所有的N-苯甲酰殼聚糖都不溶于0.5 mol/L NaOH、DMSO、CH3Cl、丙酮、DMF和乙醚，都溶于4.8%LiOH／8%尿素水溶液。N-苯甲酰殼聚糖的DS隨著反應溫度和苯甲酰氯投料量的增加而上升，隨著相轉移催化劑吡啶的比例增加呈現出先增大后減小的趨勢，原因是過量的吡啶會造成殼聚糖的析出，從而降低了DS。DS越高的樣品特性粘度越大，原因是苯環(huán)的接入會使得分子與分子之間的作用力變大，從而導致流動性變差。隨著DS的升高，特性粘度也會呈現下降的趨勢，這是因為接枝反應導致分子鏈的斷裂從而使得分子量降低，特性粘度也相應有所下降。

O-苯甲酰殼聚糖2的溶解性則較為復雜，2DS=0.43的樣品能夠部分溶于水和0.5 mol/L NaOH，溶于0.2 mol/L AcOH和4.8%LiOH/8%尿素水溶液，不溶于 DMSO、CH3Cl、丙酮、DMF 和乙醚，溶解后溶液呈淡黃色。2DS=0.53和2DS=0.75的樣品能夠部分溶于水、0.5 mol/L NaOH、CH3Cl和 DMF， 溶于0.2 mol/L AcOH、DMSO和4.8%LiOH/8%尿素水溶液，不溶于丙酮和乙醚，2DS=0.53溶解后溶液呈淡黃色，2DS=0.75溶解后溶液無色透明。2DS=1.08的樣品能夠部分溶于水、0.2 mol/L AcOH、0.5 mol/L NaOH、丙酮、氯仿和4.8%LiOH/8%尿素水溶液，溶于DMSO和DMF，溶解后溶液無色透明。 不難看出，隨著DS的上升O-苯甲酰殼聚糖的疏水性更強，能夠溶于更多的有機溶劑，而在水溶液中的溶解性開始下降。

圖4 N-苯甲酰殼聚糖1和O-苯甲酰殼聚糖2的1H NMR

表1 衍生物1和2的DS和溶解性

3 結論

本文通過定向修飾的方法獲得了兩種殼聚糖衍生物N-苯甲酰殼聚糖1和O-苯甲酰殼聚糖2，并對衍生物進行了FTIR、1H NMR表征，證實了這些衍生物的修飾成功。同時更進一步研究了接枝部位及DS對衍生物溶解性的影響，實驗結果表明：在-NH2上修飾疏水可以阻礙殼聚糖分子內和分子間氫鍵的形成，增加殼聚糖的水溶性；在-OH上修飾疏水性基團還能增加殼聚糖的有機溶劑溶解性（O-苯甲酰殼聚糖），該研究為殼聚糖的定向修飾改性提供了一定參考價值。