孫宗國，洪丹奇，謝振達，朱 勍

（浙江工業(yè)大學生物工程學院，浙江 杭州 310014）

0 引言

由于熒光生物成像具有靈敏度高、選擇性好、反應(yīng)迅速、對細胞損傷小等優(yōu)點，所以被廣泛應(yīng)用于生物檢測技術(shù)中。在生物系統(tǒng)中，生理活性物質(zhì)的特征包括低濃度，高反應(yīng)性和短壽命。因此，精準地確定這些物種的細胞內(nèi)濃度仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。為了迎合這些迫切需求，基于反應(yīng)型熒光探針出現(xiàn)了[1]。

細胞內(nèi)活性硫物質(zhì)（RSS）是含硫生物分子的總稱，這些分子在生理和病理過程中起關(guān)鍵作用。谷胱甘肽（GSH）是最豐富的細胞內(nèi)非蛋白質(zhì)硫醇，可以控制細胞內(nèi)的氧化還原活性，細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控。半胱氨酸（Cys）牽涉到兒童生長緩慢，肝損傷，皮膚病變，以及肌肉和脂肪的損失。同型半胱氨酸（Hcy）是一種導(dǎo)致阿爾茨海默病和維生素B12的不足[2]。H2S已被確定為繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的第三種氣體遞質(zhì)。在生理水平，H2S調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)和基本信號處理過程，包括監(jiān)管血管緊張度，心肌收縮力，神經(jīng)傳遞和胰島素分泌。細胞中H2S水平異?？梢哉T發(fā)許多疾病，如阿爾茨海默病，肝硬化，胃粘膜損傷以及動脈和肺部高血壓[3]。近年來，受益于H2S的化學反應(yīng)，硫化氫熒光探針迅速增加。

1 基于硝基還原成氨基的熒光探針

含有硝基熒光團的探針設(shè)計存在一個主要障礙，主要因為硝基被認為是熒光團的強烈淬滅劑。然而，硝基在溫和的條件下可以被Na2S還原生成相應(yīng)的氨基基團，這就為檢測H2S探針的設(shè)計合成提供了一種新方法。Wang等設(shè)計并合成了一種基于PET機制的熒光探針，此探針可以在HEPES緩沖液中用于胎牛血清中H2S的檢測[4]。七甲炔花菁類熒光探針通過硝基強吸電子作用產(chǎn)生PET效用，使熒光發(fā)生淬滅。另一方面，硝基被還原成氨基時，氨基是長孤電子對的強供電子基團，可能存在氨基到活性熒光團的受體激發(fā)PET過程。由于取代效應(yīng)的存在，探針顯示出熒光發(fā)射的增加，以及量子產(chǎn)率從0.05增加到0.11。此探針被應(yīng)用于RAW264.7細胞中的H2S的監(jiān)測與跟蹤。

圖1 探針作用過程Figer 1 Probe process

2 基于硒亞砜還原成硒醚熒光探針

有機硒作為抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶的活性部位，可以調(diào)節(jié)細胞抗氧化防御系統(tǒng)，防止活性氧造成的損害，硒酶的氧化還原過程主要取決于硒化物之間的雙向機制。利用催化劑的模擬循環(huán)可以幫助開發(fā)熒光探針可逆檢測硫化氫[5]。由于硒亞砜和硒醚是吸電子基團和供電子基團，熒光探針可以通過PET或ICT順利進行。Han等人設(shè)計合成了可利用有機硒基團監(jiān)測H2S和ROS之間的氧化還原循環(huán)的熒光探針，此可逆熒光探針可以檢測到H2S和HClO之間的氧化還原循環(huán)，該探針采用BODIPY熒光團作為信號傳感器和4-甲氧基苯基硒基苯作為調(diào)節(jié)劑[6]，該探針在BODIPY熒光團和4-甲氧基苯基硒基苯的PET作用下發(fā)生熒光淬滅效應(yīng)，但是氧化后的硒阻止了PET，使熒光發(fā)生Trun-on。量子產(chǎn)率從0.13增加到0.96。該探針可用于RAW264-7細胞中的HClO和H2S監(jiān)測。

圖2 探針作用過程Figer 2 Probe process

3 基于H2S親和反應(yīng)的熒光探針

H2S是可以參與活體中親核反應(yīng)的親和試劑，H2S的親和反應(yīng)主要包括邁克爾加成反應(yīng)、雙鍵加成反應(yīng)、硫解反應(yīng)。

3.1 基于邁克爾加成反應(yīng)的H2S熒光探針

Qian等人報道了采用BODIPY作為熒光團的H2S熒光探針[7]，該探針的H2S識別基團由α，β不飽和甲基丙烯酸鹽和醛基組成，醛基可以可逆地與H2S反應(yīng)形成半硫縮醛中間體，符合醛基與丙烯酸鹽的邁克爾加成反應(yīng)。該探針由于PET效應(yīng)使熒光淬滅，在與H2S反應(yīng)后熒光發(fā)生Turn-on，該探針可用于HeLa細胞中的H2S檢測。

圖3 探針作用過程Figer 3 Probe process

3.2 基于雙鍵加成反應(yīng)的H2S熒光探針

He等人設(shè)計了用于檢測H2S的比率熒光探針[8]，該探針可以認為是香豆素和花菁通過乙烯組成的混合熒光團，該探針得益于HS-與花菁在中性條件下的快速反應(yīng)，在HS-后，H2S在生理條件下，加入假吲哚C-2原子，探針的π共軛被打破，消除花菁基團的發(fā)射，保留香豆素基團發(fā)射，熒光光譜發(fā)生位移。該探針可以在30 s和80 s時間內(nèi)實現(xiàn)溶液中和細胞中H2S的快速檢測，且熒光強度增加了120倍。該探針已被應(yīng)用與MCF-7細胞線粒體中H2S的檢測。

圖4 探針作用過程Figer 4 Probe process

3.3 基于硫解反應(yīng)的H2S熒光探針

Lin等人合成了基于H2S檢測的硫解反應(yīng)的近紅外熒光探針[9]，二硝基苯基團用于保護肽中的酪氨酸合成，硫醇在一定條件下可以去除二硝基苯基團。該探針由含有費舍爾醛的BODIPY與1-氟-2，4-二硝基苯合成，該探針由活性染料的強吸電子基團的d-PET過程，變現(xiàn)出無熒光。與H2S反應(yīng)后，熒光團獲得釋放使熒光增加了18倍，檢測下限達到了10-8M。該探針可用于牛血清和MCF-7細胞中的H2S檢測。

圖5 探針作用過程Figer 5 Probe process

4 基于硫化酮沉淀的H2S熒光探針

與Cu（II）形成的金屬螯合物由于順磁性的Cu（II）可以接受熒光團的激發(fā)態(tài)電子，從而對熒光團有淬滅作用，當除去Cu2+時，熒光復(fù)蘇。這種熒光探針通常由熒光團-螯合劑-金屬離子組成。根據(jù)HSAB理論，S2-對Cu（II）具有很強的親和力，CuS沉淀相對穩(wěn)定。當探針與H2S反應(yīng)后，Cu（II）將從絡(luò)合物中消除，熒光探針再次釋放出熒光。Chang等人合成了一種檢測S2-的熒光探針[10]，探針是含有二吡啶胺的熒光素的Cu2+螯合物，該探針在水溶液中檢測限為420 nM。

圖6 探針作用過程Figer 6 Probe process

5 疊氮化物還原成胺型熒光探針

疊氮化物和其他氧化氮物種被硫化氫還原成胺的速度比GSH和其他硫醇快，是可以檢測硫化氫的。在硫化氫還原后，吸電子疊氮基團將被轉(zhuǎn)化為給電子氨基，因此，開發(fā)不同供電能力的取代基，導(dǎo)致多功能熒光探針被開發(fā)。

圖7 疊氮化物還原成胺型熒光探針總結(jié)Figer 7 Summary of strategies for fluorescent probes based on reducing azides to amines.

朱課題組研究了很多檢測硫化氫的熒光探針，在2018年，其課題組利用高效碳氫活化的方法，一步制備了全新的三氮唑喹啉類新型熒光染料[11]。此探針在8-氨基喹啉的基礎(chǔ)上，以5-三氮唑喹啉為發(fā)色團，通過引入疊氮基團，并在三氮唑基團上連接溶酶體靶向基團，成功構(gòu)建了高選擇性的硫化氫熒光探針。此探針由于喹啉與疊氮基團之間存在PET作用，使探針具有熒光淬滅效果，在硫化氫存在時，PET效應(yīng)被打破，熒光Turn-on。

6 結(jié)論與展望

圖8 探針作用過程Figer 8 Probe process

本文介紹了基于反應(yīng)型H2S熒光探針的合成與作用原理?？傊结樀拈_發(fā)完善是一項具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)，探針的開發(fā)解決了關(guān)鍵的生物問題。未來基于反應(yīng)的熒光探針設(shè)計應(yīng)注意內(nèi)源性小分子必須處于正常生理條件下。同時探針在避免天然物種的干擾下（如谷胱甘肽，半胱氨酸），應(yīng)對低濃度底物做出熒光變化，給出可靠的結(jié)果。所有這些都要求探針具有良好的選擇性，高靈敏度，良好的光穩(wěn)定性，低細胞毒性，適宜的水溶性，以及在生理pH范圍內(nèi)反應(yīng)的能力。熒光探針在臨床診斷中的應(yīng)用是最終目標。